Варикозная болезнь нижних конечностей является широко распространенным, наследственно обусловленным заболеванием. По данным международных исследований, клинически значимые изменения подкожных вен регистрируются в среднем у 40 % обследованных. В России более 30 % всего населения страдает различными формами варикозной болезни. При этом у 1 % всех обследованных выявляются различные формы трофических расстройств, такие как зажившие или активные язвенные дефекты. Ежегодно заболеваемость варикозной болезнью увеличивается в среднем на 3 % [1]. В последнее время отмечено повышение количества пациентов с хроническими заболеваниями вен в возрасте до 20 лет. Несмотря на наличие многочисленных исследований причин развития варикозной трансформации венозной стенки, в понимании патогенеза этого патологического состояния до сих пор остается много вопросов.
Согласно современным представлениям, в основе патогенеза варикозной болезни лежит генетическое нарушение в регуляции компонентов внеклеточного матрикса. Деградация компонентов, формирующих внеклеточный матрикс, происходит в результате воздействия протеолитических ферментов, синтезируемых эндотелиоцитами и макрофагами. Это сериновые протеиназы, пролиназы, цистеиновые и аспартатовые протеиназы, гликозидазы и матриксные металлопротеиназы (MMPs), которые первоначально выделяются в неактивной форме. Строгое регулирование экспрессии ММP и их деятельности является важнейшей частью гомеостаза внеклеточного матрикса. Согласно исследованиям последних лет, значительная роль в патологических изменениях сосудов при хронических заболеваниях вен отводится факторам роста – полипептидным химическим агентам, продуцируемым in situ клетками стенки сосуда (эндотелиоцитами, гладкомышечными клетками) и клетками крови (тромбоцитами, лейкоцитами). Одним из этих факторов является VEGF – сосудисто-эндотелиальный фактор роста. При ХЗВ митогенные факторы, выделяемые эндотелиальными клетками во время гипоксии, такие как фактор роста VEGF и ряд других, увеличивают пролиферативную активность гладкомышечных клеток. Предположение о сочетанном воздействии протеолитических ферментов и факторов роста на компоненты венозной стенки легло в основу современной теории патогенеза варикозной болезни нижних конечностей [8].
На сегодняшний день исследований, посвященных изучению роли матриксных металлопротеиназ в развитии заболеваний различных органов и систем достаточно много, однако в структуре научных работ крайне мало материала о связи нарушения активности матриксных металлопротеиназ и развития патологии венозной стенки. Нет данных и по влиянию дефектов генов матриксных металлопротеиназ на клинические проявления варикозной болезни и ее осложнений. Для проведения пилотного исследования в этом направлении нами были выбраны три гена-кандидата: MMP3, ММР12, VEGF. Ранее были описаны полиморфные варианты промоторных районов матриксных металлопротеиназ – 1171dupА (5А/6А) гена MMP3 и A-82G гена ММР12, которые демонстрировали разный уровень транскрипционной активности как in vitro, так и in vivo [12]. VEGF является фактором, способствующим ангиогенезу и пролиферации клеток стенки сосудов, изменения в его гене описаны с этой точки зрения при разных патологических процессах [7]. Таким образом, данные полиморфные локусы могут влиять на гомеостаз внеклеточного матрикса эндотелиальной стенки и, предположительно, приводить к развитию варикозной болезни нижних конечностей.
Цель данной работы – исследование ассоциации полиморфных вариантов – 1171dupА (5А/6А) гена MMP3, A-82G гена ММР12 и G634C гена VEGF с варикозной болезнью нижних конечностей.
Материалы и методы исследования
Первая группа включала пациентов, страдающих варикозной болезнью, у которых были проанализированы амбулаторные карты и консультационные листы. В эту группу вошли 220 человек, в том числе 161 женщин в возрасте от 16 до 75 лет и 59 мужчин в возрасте от 20 до 73 лет.
Критерии включения в группу:
1. Верифицированный диагноз: варикозная болезнь нижних конечностей клинического класса С1-С6 по СЕАР.
Критерии исключения из группы:
1. Наличие в анамнезе тромбозов глубоких вен нижних конечностей.
2. Наличие признаков тромбоза глубоких вен любой стадии и/или посттромбофлебитической болезни нижних конечностей по данным ультразвукового допплеровского ангиосканирования.
Вторую, контрольную, группу составили 100 пациентов без патологии сосудов нижних конечностей.
Верификация диагноза проводилась методом дуплексного ангиосканирования. Выделение ДНК для молекулярно-генетического тестирования из цельной венозной крови методом фенол-хлороформной экстракции по стандартной методике [2]. Определение аллельных вариантов исследуемых генов проводилось методом аллель-специфичной ПЦР в RealTime-формате.
Частоты встречаемости аллелей и генотипов определяли прямым подсчетом. Статистическая обработка данных проводилась с использованием онлайн калькулятора, доступного в сети Интернет [5].
Результаты исследования и их обсуждение
В процессе выполнения работы проведен генетический анализ 180 образцов ДНК пациентов, страдающих варикозной болезнью, и 90 образцов ДНК контрольной группы. Для всех исследованных полиморфных вариантов распределение частот встречаемости генотипов соответствует равновесию Харди – Вайнберга в контрольной и в основной групп. Данные представлены в таблице.
Частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфных локусов –1171dupА (5А/6А) гена MMP3, A-82G гена ММР12 и G634C гена VEGF в группах пациентов с варикозной болезнью и в контрольной группе
|
Полиморфный локус |
Группа |
Частота встречаемости аллеля (n) |
Частота встречаемости генотипа (n) |
Соответствие распределению Харди – Вайнберга (χ² Пирсона, df = 1), р |
|||
|
MMP3 –1171 dupА |
5A |
6A |
5A/5A |
5A/6A |
6A/6A |
||
|
Риск |
203 |
157 |
55 |
93 |
32 |
0,498200 |
|
|
Контроль |
108 |
72 |
33 |
42 |
15 |
0,792147 |
|
|
ММР12 A-82G |
A |
G |
A/A |
A/G |
G/G |
||
|
Риск |
52 |
78 |
14 |
24 |
27 |
0,062812 |
|
|
Контроль |
21 |
107 |
2 |
17 |
45 |
0,800437 |
|
|
VEGF G634C |
С |
G |
С/С |
С/G |
G/G |
||
|
Риск |
269 |
111 |
97 |
75 |
18 |
0,530419 |
|
|
Контроль |
134 |
46 |
50 |
34 |
6 |
0,946089 |
|
Статистически значимых различий в частотах встречаемости аллелей и генотипов полиморфного локуса –1171dupА (5А/6А) гена MMP3 и G634C гена VEGF в исследуемых группах не обнаружено. В то же время аллель А полиморфного локуса A-82G гена ММР12 является аллелем риска развития варикозной болезни нижних конечностей с OR = 3,397 (C.I. = [1,893–6,096], chi2 = 17,70, p = 0,00003). Гетерозиготные носители аллеля А имеют повышенный риск развития варикозной болезни нижних конечностей в 2,4 раза (p = 0,03072), а гомозиготы АА – в 11,7 (p = 0,00029) выше, чем обладатели генотипа GG.
При варикозной болезни наблюдается увеличение коллагена I типа и уменьшение коллагена III типа в гладкомышечных клетках вен. Коллаген I типа обусловливает повышенную ригидность соединительной ткани с явлением остаточной деформации. Коллаген III типа, напротив, повышает ее эластичность с сохранением исходной формы. Поэтому в варикозных венах происходит истончение и уменьшение эластичности стенок и их деформация [9]. Таким образом, высокая активность ММP-3, обусловленная наличием аллеля 5А, может способствовать истончению стенки вены и образованию вариксов посредством чрезмерной деградации коллагена III. Однако наши данные указывают на отсутствие ассоциации аллелей и генотипов полиморфного локуса –1171dupА (5А/6А) гена MMP3 с развитием варикозной болезни. Это может быть связано с дополнительными компенсаторными возможностями клеток соединительной ткани в регуляции количества коллагена III в стенке вены: либо через усиление его синтеза de novo, либо через усиление инактивации MMP3. В таком случае, компенсация будет эффективна на ранних стадиях развития заболевания, в то время как с прогрессированием патологии сосудистой стенки отрицательные эффекты должны стать преобладающими. В дальнейшем для проверки этой гипотезы и с увеличением количества пациентов мы планируем разделить группу риска на подгруппы с разными клиническими классами варикозной болезни и провести более подробные ассоциативные исследования.
MMP12 (локус 11q22.3) выделяется активированными макрофагами и приводит к разрушению нескольких компонентов внеклеточного матрикса, что позволяет макрофагам проникать в район повреждения тканей [6, 10]. MMP12 может блокировать ангиогенез путем преобразования плазминогена в ангиостатин, мощный ингибитор ангиогенеза. Полиморфный локус A-82G гена ММР12 находится очень близко к сайту связывания транскрипционного фактора AP1, что влияет на эффективность его взаимодействия с промотором. В последнее время показана ассоциация данного полиморфного варианта с развитием ишемической болезни сердца, рака и эндометриоза [4, 11, 12].
Вследствие воспалительной реакции происходит активация и высвобождение свободных радикалов, протеаз, приводящих к деструкции коллагеновых волокон венозной стенки. В свою очередь увеличивается пролиферативная активность гладкомышечных клеток, но новообразованные гладкомышечные клетки синтезируют в большом количестве составляющие межклеточного вещества и резко снижают синтез сократительных элементов. Морфологически это проявляется дезорганизацией соединительной ткани и утолщением tunica media венозной стенки, а функционально – уменьшением каркасной функции и общей сократимости вены, что приводит к патологической перестройке и расширению вен.
В нашем исследовании аллель А полиморфного локуса A-82G гена ММР12 проявил себя как значительный фактор риска развития варикозной болезни нижних конечностей (OR = 3,397). При рассмотрении генотипов как для гетерозиготных, так и для гомозиготных носителей аллеля А риск развития варикозной болезни нижних конечностей увеличивался в 2,4 и в 11,7 раза, чем у обладателей генотипа GG, соответственно. Это указывает на важность хронического воспаления (обусловленного эффектами тканевых макрофагов) при ремоделировании венозной стенки. Возможно, при наличии повреждающих факторов процесс восстановления венозной стенки у носителей аллеля А гена ММР12 затягивается, что приводит к развитию варикозной болезни нижних конечностей.
Сосудисто-эндотелиальный фактор роста VEGF выделяется в повышенных количествах клеточными элементами сосудистой стенки в состоянии гипоксии, сопровождающей хронические воспалительные реакции. Эффекты этого митогена многочисленны – стимуляция ангиогенеза, повышение проницаемости сосудистой стенки, пролиферация эндотелиоцитов. Усиление подобных реакций в перивазальном пространстве уже само по себе может приводить к дезорганизации тканей стенки вены, а также потенцировать изменения на фоне хронического воспаления. Ассоциации с полиморфными вариантами гена VEGF показаны для ряда опухолей, диабетической ретинопатии и других заболеваний [3].
При исследовании влияния полиморфного аллеля G634C гена VEGF на риск развития варикозной болезни нижних конечностей не обнаружено различий с группой здоровых лиц; объяснение тому может содержаться в особенностях микроокружения венозных сосудов, отличных от артерий. Кроме того, необходимо отметить, что увеличение объема выборки может изменить отношение шансов для данного полиморфизма в любую сторону.
Таким образом, наличие полиморфных вариантов гена ММР-12 может служить ранним маркером развития структурных изменений стенки вен и варикозной болезни нижних конечностей. Полученные результаты представляют огромную ценность для ранней диагностики и первичной профилактики заболеваний вен нижних конечностей, что поможет значительно снизить количество инвалидизирующих форм варикозной болезни, особенно у лиц молодого, трудоспособного возраста.
Рецензенты:Смагин А.А., д.м.н., профессор, руководитель лаборатории лимфодетоксикации, Учреждение Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск;
Майбородин И.В., д.м.н., профессор, научный консультант АНО «Центр новых медицинских технологий», г. Новосибирск.