Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Шевела А.И. 1 Новак Е.В. 1 Серяпина Ю.В. 1 Морозов В.В. 1 Воронина Е.Н. 1

---

1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

Цель работы – исследование ассоциации полиморфных вариантов – 1171dupА (5А/6А) гена MMP3 (матриксная металлопротеиназа 3), A-82G гена ММР12 (матриксная металлопротеиназа 12) и G634C гена VEGF (сосудисто-эндотелиальный фактор роста) с развитием варикозной болезни нижних конечностей. Материалы и методы. В основную группу вошли 220 пациентов с варикозной болезнью нижних конечностей клинического класса С1-С6 по СЕАР, группу контроля составили 100 человек без венозной патологии. При формировании групп диагноз верифицирован методом дуплексного ультразвукового ангиосканирования. Генетическое исследование образцов ДНК, выделенных из венозной крови, проведено методом Real-Time ПЦР. Результаты. Распределение частот встречаемости аллелей всех исследованных генов соответствовало равновесию Харди – Вайнберга, р > 0,05. Для полиморфизмов ММР3 и VEGF значимых различий частот встречаемости между группами не обнаружено. Наличие в генотипе аллеля А полиморфного локуса A-82G гена ММР12 является фактором риска развития варикозной болезни нижних конечностей с OR = 3,397 (p = 0,00003), причем наибольший риск имеет место при гомозиготном носительстве этого аллеля – OR = 11,7 (p = 0,00029). Заключение. Наличие в генотипе полиморфных аллелей матриксной металлопротеиназы ММР-12 может служить маркером наследственной предрасположенности к развитию структурных изменений стенки вен и варикозной болезни нижних конечностей. Исследования по поиску генетических предикторов варикозной болезни являются основополагающими для развития персонализированных подходов во флебологии и представляют огромную ценность для ранней диагностики и первичной профилактики заболеваний вен нижних конечностей. Своевременное выявление и формирование групп риска позволит значительно снизить количество инвалидизирующих форм варикозной болезни, особенно у лиц молодого, трудоспособного возраста.

Статья в формате PDF

290 KB

варикозная болезнь

матриксные металлопротеиназы

ММР3

ММР12

VEGF

полиморфизм

персонализированная медицина

1. Феоник О.В., Грязев С.М., Семенов А.Ю., Бубнова Н.А. Патогенетические механизмы трофических расстройств, возникающих на фоне хронической венозной недостаточности нижних конечностей // Вестник Санкт-Петербургского университета. – 2006. – Сер. 11. – Вып. 3. – С. 39–49.

2. Bendeck M. P. Targeting Pericellular Proteolysis in Vascular Disease // Circ. Res. – 2002. – Vol. 91. – P. 861–862.

3. Birk D.M., Barbato J., Mureebe L., Chaer R.A. Current insights on the biology and clinical aspects of VEGF regulation // Vasc Endovascular Surg. – 2008. – Vol. 42, № 6. – P. 517–530.

4. Borghese B., Chiche J.D., Vernerey D., Chenot C., Mir O., Bijaoui G., Bonaiti-Pellié C., Chapron C. Genetic polymorphisms of matrix metalloproteinase 12 and 13 genes are implicated in endometriosis progression // Hum Reprod. – 2008. – № 23. – P. 1207–1213.

5. Hardy-Weinberg equilibrium (2014), Available at: http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl (accessed 9 September 2014).

6. Hollingsworth S.J., Powell G.l., Barker S.G., Co oper D.G. Primary varicose veins: altered transcription of VEGF and its receptors (KDR, flt-1, soluble flt-1) with sapheno-femoral junction incompetence // Eur J Vasc Endovasc Surg. – 2004. – Vol. 27, № 3. – P. 259–268.

7. Jormsjo S., Ye S., Moritz J., Walter D.H., Dim meler S., Zeiher A.M., Henney A., Hamsten A., Eriksson P. Allele-specific regulation of matrix metalloproteinase-12 gene activity is associated with coronary artery luminal dimensions in diabetic patients with manifest coronary artery disease // Circ Res. – 2000. – № 86. – P. 998–1003.

8. Raffetto J.D., Khalil R.A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease // Biochemical pharmacology. – 2008. – Vol.2. – № 75. – P. 346–359.

9. Sansilvestri-Morel P., Fioretti F., Rupin A., Senni K., Fabiani J.N., Godea, G., Verbeuren T.J. Comparison of extracellular matrix in skin and saphenous veins from patients with varicose veins: does the skin reflect venous matrix changes? // Clinical Science – 2007. – № 112. – P. 229–239.

10. Shapiro S.D., Kobayashi8 D.K., Ley T.J. Cloning and characterization of a unique elastolytic metalloproteinase produced by human alveolar macrophages // J Biol Chem. – 1993. – № 268. – P. 23824–23829.

11. Su L., Zhou W., Asomaning K., Lin X., Wain J.C., Lynch T.J., Liu G., Christiani D.C. Genotypes and haplotypes of matrix metalloproteinase 1, 3 and 12 genes and the risk of lung cance // Carcinogenesis. – 2006. – № 27. – P. 1024–1029.

12. Ye S., Eriksson P., Hamsten A., Kurkinen M., Humphries S.E., Henney A.M. Progression of coronary atherosclerosis is associated with a common genetic variant of the human stromelysin-1 promoter which results in reduced gene expression // J Biol Chem. – 1996. – № 271. – P. 13055–13060.

Варикозная болезнь нижних конечностей является широко распространенным, наследственно обусловленным заболеванием. По данным международных исследований, клинически значимые изменения подкожных вен регистрируются в среднем у 40 % обследованных. В России более 30 % всего населения страдает различными формами варикозной болезни. При этом у 1 % всех обследованных выявляются различные формы трофических расстройств, такие как зажившие или активные язвенные дефекты. Ежегодно заболеваемость варикозной болезнью увеличивается в среднем на 3 % [1]. В последнее время отмечено повышение количества пациентов с хроническими заболеваниями вен в возрасте до 20 лет. Несмотря на наличие многочисленных исследований причин развития варикозной трансформации венозной стенки, в понимании патогенеза этого патологического состояния до сих пор остается много вопросов.

Согласно современным представлениям, в основе патогенеза варикозной болезни лежит генетическое нарушение в регуляции компонентов внеклеточного матрикса. Деградация компонентов, формирующих внеклеточный матрикс, происходит в результате воздействия протеолитических ферментов, синтезируемых эндотелиоцитами и макрофагами. Это сериновые протеиназы, пролиназы, цистеиновые и аспартатовые протеиназы, гликозидазы и матриксные металлопротеиназы (MMPs), которые первоначально выделяются в неактивной форме. Строгое регулирование экспрессии ММP и их деятельности является важнейшей частью гомеостаза внеклеточного матрикса. Согласно исследованиям последних лет, значительная роль в патологических изменениях сосудов при хронических заболеваниях вен отводится факторам роста – полипептидным химическим агентам, продуцируемым in situ клетками стенки сосуда (эндотелиоцитами, гладкомышечными клетками) и клетками крови (тромбоцитами, лейкоцитами). Одним из этих факторов является VEGF – сосудисто-эндотелиальный фактор роста. При ХЗВ митогенные факторы, выделяемые эндотелиальными клетками во время гипоксии, такие как фактор роста VEGF и ряд других, увеличивают пролиферативную активность гладкомышечных клеток. Предположение о сочетанном воздействии протеолитических ферментов и факторов роста на компоненты венозной стенки легло в основу современной теории патогенеза варикозной болезни нижних конечностей [8].

На сегодняшний день исследований, посвященных изучению роли матриксных металлопротеиназ в развитии заболеваний различных органов и систем достаточно много, однако в структуре научных работ крайне мало материала о связи нарушения активности матриксных металлопротеиназ и развития патологии венозной стенки. Нет данных и по влиянию дефектов генов матриксных металлопротеиназ на клинические проявления варикозной болезни и ее осложнений. Для проведения пилотного исследования в этом направлении нами были выбраны три гена-кандидата: MMP3, ММР12, VEGF. Ранее были описаны полиморфные варианты промоторных районов матриксных металлопротеиназ – 1171dupА (5А/6А) гена MMP3 и A-82G гена ММР12, которые демонстрировали разный уровень транскрипционной активности как in vitro, так и in vivo [12]. VEGF является фактором, способствующим ангиогенезу и пролиферации клеток стенки сосудов, изменения в его гене описаны с этой точки зрения при разных патологических процессах [7]. Таким образом, данные полиморфные локусы могут влиять на гомеостаз внеклеточного матрикса эндотелиальной стенки и, предположительно, приводить к развитию варикозной болезни нижних конечностей.

Цель данной работы – исследование ассоциации полиморфных вариантов – 1171dupА (5А/6А) гена MMP3, A-82G гена ММР12 и G634C гена VEGF с варикозной болезнью нижних конечностей.

Материалы и методы исследования

Первая группа включала пациентов, страдающих варикозной болезнью, у которых были проанализированы амбулаторные карты и консультационные листы. В эту группу вошли 220 человек, в том числе 161 женщин в возрасте от 16 до 75 лет и 59 мужчин в возрасте от 20 до 73 лет.

Критерии включения в группу:

1. Верифицированный диагноз: варикозная болезнь нижних конечностей клинического класса С1-С6 по СЕАР.

Критерии исключения из группы:

1. Наличие в анамнезе тромбозов глубоких вен нижних конечностей.

2. Наличие признаков тромбоза глубоких вен любой стадии и/или посттромбофлебитической болезни нижних конечностей по данным ультразвукового допплеровского ангиосканирования.

Вторую, контрольную, группу составили 100 пациентов без патологии сосудов нижних конечностей.

Верификация диагноза проводилась методом дуплексного ангиосканирования. Выделение ДНК для молекулярно-генетического тестирования из цельной венозной крови методом фенол-хлороформной экстракции по стандартной методике [2]. Определение аллельных вариантов исследуемых генов проводилось методом аллель-специфичной ПЦР в RealTime-формате.

Частоты встречаемости аллелей и генотипов определяли прямым подсчетом. Статистическая обработка данных проводилась с использованием онлайн калькулятора, доступного в сети Интернет [5].

Результаты исследования и их обсуждение

В процессе выполнения работы проведен генетический анализ 180 образцов ДНК пациентов, страдающих варикозной болезнью, и 90 образцов ДНК контрольной группы. Для всех исследованных полиморфных вариантов распределение частот встречаемости генотипов соответствует равновесию Харди – Вайнберга в контрольной и в основной групп. Данные представлены в таблице.

Частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфных локусов –1171dupА (5А/6А) гена MMP3, A-82G гена ММР12 и G634C гена VEGF в группах пациентов с варикозной болезнью и в контрольной группе

Статистически значимых различий в частотах встречаемости аллелей и генотипов полиморфного локуса –1171dupА (5А/6А) гена MMP3 и G634C гена VEGF в исследуемых группах не обнаружено. В то же время аллель А полиморфного локуса A-82G гена ММР12 является аллелем риска развития варикозной болезни нижних конечностей с OR = 3,397 (C.I. = [1,893–6,096], chi2 = 17,70, p = 0,00003). Гетерозиготные носители аллеля А имеют повышенный риск развития варикозной болезни нижних конечностей в 2,4 раза (p = 0,03072), а гомозиготы АА – в 11,7 (p = 0,00029) выше, чем обладатели генотипа GG.

При варикозной болезни наблюдается увеличение коллагена I типа и уменьшение коллагена III типа в гладкомышечных клетках вен. Коллаген I типа обусловливает повышенную ригидность соединительной ткани с явлением остаточной деформации. Коллаген III типа, напротив, повышает ее эластичность с сохранением исходной формы. Поэтому в варикозных венах происходит истончение и уменьшение эластичности стенок и их деформация [9]. Таким образом, высокая активность ММP-3, обусловленная наличием аллеля 5А, может способствовать истончению стенки вены и образованию вариксов посредством чрезмерной деградации коллагена III. Однако наши данные указывают на отсутствие ассоциации аллелей и генотипов полиморфного локуса –1171dupА (5А/6А) гена MMP3 с развитием варикозной болезни. Это может быть связано с дополнительными компенсаторными возможностями клеток соединительной ткани в регуляции количества коллагена III в стенке вены: либо через усиление его синтеза de novo, либо через усиление инактивации MMP3. В таком случае, компенсация будет эффективна на ранних стадиях развития заболевания, в то время как с прогрессированием патологии сосудистой стенки отрицательные эффекты должны стать преобладающими. В дальнейшем для проверки этой гипотезы и с увеличением количества пациентов мы планируем разделить группу риска на подгруппы с разными клиническими классами варикозной болезни и провести более подробные ассоциативные исследования.

MMP12 (локус 11q22.3) выделяется активированными макрофагами и приводит к разрушению нескольких компонентов внеклеточного матрикса, что позволяет макрофагам проникать в район повреждения тканей [6, 10]. MMP12 может блокировать ангиогенез путем преобразования плазминогена в ангиостатин, мощный ингибитор ангиогенеза. Полиморфный локус A-82G гена ММР12 находится очень близко к сайту связывания транскрипционного фактора AP1, что влияет на эффективность его взаимодействия с промотором. В последнее время показана ассоциация данного полиморфного варианта с развитием ишемической болезни сердца, рака и эндометриоза [4, 11, 12].

Вследствие воспалительной реакции происходит активация и высвобождение свободных радикалов, протеаз, приводящих к деструкции коллагеновых волокон венозной стенки. В свою очередь увеличивается пролиферативная активность гладкомышечных клеток, но новообразованные гладкомышечные клетки синтезируют в большом количестве составляющие межклеточного вещества и резко снижают синтез сократительных элементов. Морфологически это проявляется дезорганизацией соединительной ткани и утолщением tunica media венозной стенки, а функционально – уменьшением каркасной функции и общей сократимости вены, что приводит к патологической перестройке и расширению вен.

В нашем исследовании аллель А полиморфного локуса A-82G гена ММР12 проявил себя как значительный фактор риска развития варикозной болезни нижних конечностей (OR = 3,397). При рассмотрении генотипов как для гетерозиготных, так и для гомозиготных носителей аллеля А риск развития варикозной болезни нижних конечностей увеличивался в 2,4 и в 11,7 раза, чем у обладателей генотипа GG, соответственно. Это указывает на важность хронического воспаления (обусловленного эффектами тканевых макрофагов) при ремоделировании венозной стенки. Возможно, при наличии повреждающих факторов процесс восстановления венозной стенки у носителей аллеля А гена ММР12 затягивается, что приводит к развитию варикозной болезни нижних конечностей.

Сосудисто-эндотелиальный фактор роста VEGF выделяется в повышенных количествах клеточными элементами сосудистой стенки в состоянии гипоксии, сопровождающей хронические воспалительные реакции. Эффекты этого митогена многочисленны – стимуляция ангиогенеза, повышение проницаемости сосудистой стенки, пролиферация эндотелиоцитов. Усиление подобных реакций в перивазальном пространстве уже само по себе может приводить к дезорганизации тканей стенки вены, а также потенцировать изменения на фоне хронического воспаления. Ассоциации с полиморфными вариантами гена VEGF показаны для ряда опухолей, диабетической ретинопатии и других заболеваний [3].

При исследовании влияния полиморфного аллеля G634C гена VEGF на риск развития варикозной болезни нижних конечностей не обнаружено различий с группой здоровых лиц; объяснение тому может содержаться в особенностях микроокружения венозных сосудов, отличных от артерий. Кроме того, необходимо отметить, что увеличение объема выборки может изменить отношение шансов для данного полиморфизма в любую сторону.

Таким образом, наличие полиморфных вариантов гена ММР-12 может служить ранним маркером развития структурных изменений стенки вен и варикозной болезни нижних конечностей. Полученные результаты представляют огромную ценность для ранней диагностики и первичной профилактики заболеваний вен нижних конечностей, что поможет значительно снизить количество инвалидизирующих форм варикозной болезни, особенно у лиц молодого, трудоспособного возраста.

Смагин А.А., д.м.н., профессор, руководитель лаборатории лимфодетоксикации, Учреждение Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск;

Майбородин И.В., д.м.н., профессор, научный консультант АНО «Центр новых медицинских технологий», г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 10.12.2014.

Библиографическая ссылка