Актуальность изучения механизмов нарушений консолидации при переломах длинных костей конечностей определяется значительной частотой возникновения данных осложнений, трудностью их лечения и высоким уровнем инвалидности [4, 7]. В последние десятилетия течение многих заболеваний и осложнений, в том числе и нарушений консолидации, значительно изменилось и приобрело скрытый характер, что представляет значительные сложности, как в диагностике, так и в лечении [3].
Доказано, что к одним из основных факторов, определяющих особенности исхода при переломах, относится иммунная система, нарушение которой может приводить к развитию различных осложнений [3, 8]. Иммунные клетки секретируют многочисленные растворимые медиаторы (цитокины), играющие важнейшую роль в различных физиологических и патологических процессах организма. Одними из таких клеточных медиаторов, играющих важную роль в регуляции обменных и восстановительных процессов, являются ростовые факторы – трансформирующий фактор роста β1 (TGF β1) и эпидермальный фактор роста (EGF) [1].
TGFβ1 – это мультипотентный цитокин, являющийся важным модулятором клеточного роста, воспаления, пролиферации и дифференцировки, внеклеточного матричного депонирования и апоптоза [9]. TGFβ1 активирует фибробласты, способствует процессам репарации ран и непосредственно стимулирует ангиогенез [2].
EGF стимулирует пролиферацию фибробластов и влияет на продукцию ими простагландинов, протеогликанов, коллагена, ростовых факторов и ряда цитокинов, включая колониестимулирующие факторы, интерлейкины и интерферон, что в конечном итоге способствует ускорению регенерации раневого процесса [12, 16]. EGF осуществляет свое действие с участием мембранного рецептора – EGFR, который принадлежит к семейству рецепторов ErbB. Рецепторы данного семейства состоят из внеклеточного лиганд-связывающего домена, гидрофобного трансмембранного домена и внутриклеточного домена, обладающего тирозинкиназной активностью и играющего ключевую роль при запуске внутриклеточных путей передачи сигнала [14]. Хотя рецептор EGF был открыт более 30 лет назад, механизм его активации до сих пор не ясен и интенсивно исследуется [10, 11, 13].
Согласно исследованиям последних лет определенная роль в развитии осложнений отводится наследственным факторам. Генетически запрограммированный повышенный или пониженный синтез цитокинов сказывается на способности иммунной системы человека реагировать на разные виды патогенов и на развитии целого ряда иммунопатологических процессов [1]. Однако, несмотря на широкомасштабные исследования генетического полиморфизма регуляторных и адгезивных молекул при различных заболеваниях, почти не коснулись проблем травматологии, в которой патогенез осложнений при травме имеет свои особенности [5].
В связи с вышесказанным изучение генетического полиморфизма цитокинов, принимающих участие в механизмах регуляции межклеточных взаимодействий у больных при травме, а также поиски генетических маркеров развития осложнений представляется перспективным как в теоретическом, так и практическом отношениях.
Цель исследования – изучить частоту встречаемости генотипов полиморфного маркера гена трансформирующего ростового фактора бета-1 (TGFβ1 Arg25Pro) и рецептора в гене эпидермального фактора роста (EGFR A2073T) у пациентов с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей и развитием замедленной консолидации.
Материалы и методы исследования
В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2011 – поправки) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утверждёнными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Проведено обследование 108 пациентов в возрасте от 20 до 40 лет с переломами длинных костей конечностей. Первую группу составили 62 пациента (мужчины – 82,3 %, женщины – 17,7 %) с неосложненным течением переломов (группа клинического сравнения). Вторую группу составили 46 больных (мужчины – 82,6 %, женщины – 17,4 %). У пациентов данной группы в раннем послеоперационном периоде каких-либо осложнений не зарегистрировано, однако в позднем периоде зафиксировано нарушение консолидации переломов по типу замедленной консолидации. Полученные данные сравнивались с результатами исследований, проведенных у 100 практически здоровых доноров в возрасте от 20 до 40 лет. В работе с закрытыми и открытыми переломами использовалась классификация М.Е. Mюллера и соавт. (1996), (табл. 1) [15].
Таблица 1
Распределение больных по характеру и локализации переломов %
|
Тип перелома
Группа |
IO2, MT2,NT1 |
IO3, MT2,NT1 |
IO4, MT3,NT1 |
32А2 |
33С2 |
41С2 |
42А2 |
42С1 |
43А1 |
Итого |
|
I |
17,74 |
12,9 |
3,23 |
12,9 |
4,83 |
3,2 |
21 |
12,9 |
11,3 |
100 |
|
II |
19,6 |
13 |
2,2 |
13 |
4,3 |
2,2 |
23,9 |
10,9 |
10,9 |
100 |
Всем пациентам с закрытыми переломами проводилась открытая репозиция отломков с последующим металлоостеосинтезом пластинами или штифтами. Больным с открытыми переломами при поступлении выполнялась первичная хирургическая обработка и наложение аппаратов наружной фиксации. В дальнейшем применялась традиционная консервативная терапия (антибактериальные средства, дезагреганты, местное медикаментозное лечение и др.). Сформированные группы являлись относительно однородными как по возрасту, полу, характеру и локализации переломов, так и по проводимому лечению. Из групп исключались пациенты с какой-либо сопутст вующей патологией.
Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови. Для исследования выбрана точковая мутация TGFβ1 в позиции 25 (Arg > Pro) и мутация рецептора EGFR в позиции 2073 (A > T). Амплификацию фрагмента исследуемых генов проводили в термоцикле (модель Ре «Бис» – М111 (ООО «Бис-Н», Новосибирск). В работе использовались стандартные наборы праймеров научно-производственной фирмы «Литех» – «SNP» (Москва). Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 3 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия в проходящем ультрафиолетовом свете [5].
Полученные данные обработаны с помощью программы «BIOSTAT». Статистический анализ полученных данных проведен с использованием критерия χ2. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05. Для оценки ассоциаций аллелей с генотипом рассчитывали относительный риск (ОР) [6].
Результаты исследования и их обсуждение
Распределение распространенности генотипов полиморфного локуса Arg25Pro гена TGFβ1 и локуса A2073T гена EGFR у больных с неосложненным течением переломов, развитием замедленной консолидации и контрольной группы соответствовало ожидаемому равновесию Харди – Вайнберга.
По данным распределения распространенности аллелей и генотипов гена TGFβ1 Arg25Pro у больных с развитием замедленной консолидации переломов получены достоверные различия как с группой здоровых лиц, так и с группой клинического сравнения (табл. 2, 3).
При этом отмечено, что частота носительства генотипа –25Arg/Arg, –25Arg/Pro и –25Pro/Pro гена TGFβ1, а также аллеля –25Arg– и аллеля –25Pro у больных с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей не отличалась от группы контроля (р = 0,62, р = 0,6 соответственно). Напротив, в группе с развитием замедленной консолидации в позднем периоде травмы регистрировалось достоверно частое обнаружение генотипа –25Pro/Pro и редкое – генотипа –25Arg/Arg гена TGFβ1, не только в сравнении с группой здоровых резидентов, но и с больными с неосложнённым течением переломов (р = 0,0001) (табл. 2, 3).
Таблица 2
Частота генотипов гена TGFβ1-25Arg > Pro и его аллельных вариантов среди здоровых резидентов и пациентов с неосложненным и осложненным (замедленная консолидация) течением переломов длинных костей конечностей (χ2, df = 1)
|
Контроль, n = 100 |
Неосложненное течение, n = 62 |
Замедленная консолидация, n = 46 |
|
|
Аллель Arg OR [95 % CI] |
0,74 |
0,77 1,15 [0,68–1,94] |
0,38 0,22 [0,13–0,37] |
|
Аллель Pro OR [95 % CI] χ2 р |
0,26 |
0,23 0,87 [0,52–1,46] 0,28 0,6 |
0,62 4,64 [2,74–7,85] 34,82 0,0001 |
|
Генотип ArgArg OR [95 % CI] |
0,6 |
0,58 0,92 [0,48–1,76] |
0,28 0,26 [0,12–0,56] |
|
Генотип ArgPro OR [95 % CI] |
0,28 |
0,37 1,52 [0,77–2,98] |
0,2 0,63 [0,27–1,46] |
|
Генотип ProPro OR [95 % CI] χ2 р |
0,12 |
0,05 0,37 [0,1–1,38] 0,24 0,62 |
0,52 8,0 [3,47–18,45] 27,85 0,0001 |
Примечание. Статистическая значимость различий с контролем.
Таблица 3
Частота аллельных вариантов гена TGFβ1-25Arg > Pro и его генотипов среди пациентов с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей и развитием замедленной консолидации (χ2, df = 1)
|
Неосложненное течение (n = 62) |
Замедленная консолидация (n = 46) |
χ2 |
р |
OR [95 % CI] |
|
|
Аллель Arg |
0,77 |
0,38 |
32,79 |
0,0001 |
0,19 [0,1–0,34] |
|
Аллель Pro |
0,23 |
0,62 |
5,33 [2,95–9,64] |
||
|
Генотип ArgArg |
0,58 |
0,28 |
23,73 |
0,0001 |
0,28 [0,13–0,64] |
|
Генотип ArgPro |
0,37 |
0,2 |
0,41 [0,17–1,01] |
||
|
Генотип ProPro |
0,05 |
0,52 |
21,45 [5,87–78,43] |
Примечание. р – статистическая значимость различий между группами.
Расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию аллеля –25Pro гена TGFβ1 с развитием замедленной консолидации переломов длинных костей (5,33 ДИ [2,95–9,64]). Генотип –25Pro/Pro гена TGFβ1 также ассоциирован с развитием замедленной консолидации (ОР 21,45 при доверительном интервале – ДИ от 5,87 до 78,43), (табл. 3).
Распределение генотипов EGFR-2073A > T и частоты его аллельных вариантов у здоровых лиц и у пациентов с переломами длинных костей представлены в табл. 4 и 5.
Таблица 4
Частота генотипов гена EGFR-2073A > T и его аллельных вариантов среди здоровых резидентов и пациентов с неосложненным и осложненным (замедленная консолидация) течением переломов длинных костей конечностей (χ2, df = 1)
|
Контроль, n = 100 |
Неосложненное течение, n = 62 |
Замедленная консолидация, n = 46 |
|
|
Аллель A OR [95 % CI] |
0,605 |
0,605 1,0 [0,63–1,58] |
0,315 0,3 [0,18–0,51] |
|
Аллель Т OR [95 % CI] χ2 р |
0,395 |
0,395 1,0 [0,63–1,58] 0,00 1 |
0,685 3,33 [1,97–5,62] 21,18 0,0001 |
|
Генотип АА OR [95 % CI] |
0,29 |
0,306 1,08 [0,54–2,16] |
0,13 0,37 [0,14–0,96] |
|
Генотип АТ OR [95 % CI] |
0,63 |
0,597 0,87 [0,45–1,66] |
0,37 0,34 [0,17–0,71] |
|
Генотип ТТ OR [95 % CI] χ2 р |
0,08 |
0,097 1,23 [0,41–3,74] 0,00 1 |
0,5 11,5 [4,56–29,01] 23,45 0,0001 |
Примечание. Статистическая значимость различий с контролем.
Таблица 5
Частота аллельных вариантов гена EGFR-2073A > T и его генотипов среди пациентов с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей и развитием замедленной консолидации и (χ2, df = 1)
|
Неосложненное течение (n = 62) |
Замедленная консолидация (n = 46) |
χ2 |
р |
OR [95 % CI] |
|
|
Аллель A |
0,605 |
0,315 |
17,74 |
0,0001 |
0,3 [0,17–0,53] |
|
Аллель Т |
0,395 |
0,685 |
3,33 [1,88–5,87] |
||
|
Генотип АА |
0,306 |
0,13 |
17,77 |
0,0001 |
0,34 [0,12–0,94] |
|
Генотип AТ |
0,597 |
0,37 |
0,4 [0,18–0,87] |
||
|
Генотип ТТ |
0,097 |
0,5 |
9,33 [3,36–25,92] |
Примечание. р – статистическая значимость различий между группами.
Распространенность генотипов –2073А/А, –2073А/Т и –2073Т/Т гена EGFR оказалась одинаково частой у здоровых лиц и у больных группы клинического сравнения. В то же время генотип –2073Т/Т гена EGFR в 6,3 раза чаще регистрировался у пациентов с нарушением консолидации по типу замедленной консолидации по сравнению со здоровыми лицами (р = 0,0001) и в 5,2 раза чаще, чем у пациентов с неосложненным течением переломов (р = 0,0001). Расчет относительного риска также выявил положительную ассоциацию генотипа –2073Т/Т гена EGFR с развитием замедленной консолидации переломов длинных костей, как с группой контроля, так и группой клинического сравнения (ОР = 11,5, ДИ [4,56–29,01 и ОР = 9,33, ДИ [3,36–25,92] соответственно).
При сравнении частоты аллельных вариантов гена EGFR-2073A > T выявлено, что при замедленной консолидации переломов аллель –2073Т встречается с частотой 0,685, что достоверно чаще, чем у здоровых индивидуумов и пациентов с отсутствием осложнений при переломах (р = 0,0001), а расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию данного аллеля с развитием замедленной консолидации (ОР = 3,33, ДИ [1,88–5,87]) (табл. 4, 5)
Таким образом, определение полиморфизма генов молекул ростовых факторов (TGFβ1-25Arg > Pro, EGFR-2073A > T) у пациентов с переломами длинных костей конечностей дает возможность осуществлять индивидуальный прогноз течения репаративных процессов, что в конечном итоге позволит проводить необходимые персонализированные профилактические мероприятия и значительно увеличить качество жизни пациента.
Выводы
1. Распространенность генотипов полиморфных молекул гена TGFβ1-25Arg > Pro, EGFR-2073A > T и их аллельных вариантов у пациентов с неосложненным течением переломов не отличается от здоровых лиц.
2. Генотип –25Pro/Pro полиморфизма гена TGFβ1 и генотип –2073Т/Т полиморфизма гена EGFR ассоциированы с развитием замедленной консолидации переломов.
Рецензенты:Цыбиков Н.Н., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита;
Намоконов Е.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой общей и специализированной хирургии с курсом топографической анатомии и оперативной хирургии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита.
Работа поступила в редакцию 10.12.2014.