Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Мироманов А.М. 1 Гусев К.А. 1 Усков С.А. 2

---

1 ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России

2 Министерство здравоохранения Забайкальского края

Представлены результаты исследования встречаемости генотипов полиморфного маркера гена трансформирующего ростового фактора бета-1 (TGFβ1 Arg25Pro) и рецептора эпидермального фактора роста (EGFR A2073T) у больных с переломами длинных костей конечностей в Забайкальском крае. Первую группу составили 62 пациента с неосложненным течением переломов (группа клинического сравнения). Вторую группу (n = 46) – больные с замедленной консолидацией (в раннем послеоперационном периоде осложнений не зарегистрировано, однако в позднем периоде зафиксировано нарушение консолидации переломов по типу замедленной консолидации). Контрольную группу составили 100 практически здоровых доноров в возрасте от 20 до 40 лет. Установлено, что распространенность генотипов полиморфных молекул гена TGFβ1 Arg25Pro и рецептора EGFR в гене A2073T у пациентов с неосложненным течением переломов не отличается от здоровых лиц. Генотип Pro/Pro полиморфизма гена TGFβ1 (Arg25Pro) и генотип Т/Т полиморфизма рецептора EGFR в гене A2073T ассоциированы с развитием замедленной консолидации переломов.

Статья в формате PDF

292 KB

полиморфизм

цитокины

переломы

замедленная консолидация

1. Кетлинский С.А. Цитокины / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев. – СПб.: Фолиант, 2008. – 552 с.

2. Маленькая молекула и большая болезнь / А.С. Рудой и [др.] // Вестник Российской военно-медицинской академии. – 2009. – № 3(27). – С. 166–172.

3. Мироманов А.М. Переломы длинных костей конечностей: прогностические критерии развития осложнений: автореф. дис. … д-ра мед. наук: 14.01.15, 14.03.03. – Курган, 2013. – 41 с.

4. Павлов, Д.В. Интрамедуллярный остеосинтез при лечении несросшихся переломов и ложных суставов большеберцовой кости / Д.В. Павлов, А.Е. Новиков // Травматология и ортопедия России. – 2009. – № 2. – С. 106–111.

5. Полиморфизм гена TNF-α (G-308А) у больных с гнойно-воспалительными осложнениями при переломах длинных костей конечностей в Забайкальском крае [Электронный ресурс] / А.М. Мироманов и [др.] // Забайкальский медицинский вестник. – 2013. – № 1. – С. 41–45. – Режим доступа: http://chitgma.ru/zmv2.

6. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. – М.: МедиаСфера, 2002. – 312 с.

7. Сочетанное применение обогащенной тромбоцитами аутоплазмы и биокомпозиционного материала Коллапан в комплексном лечении больных с длительно несрастающими переломами и ложными суставами длинных костей конечностей / Г.А. Кесян, [и др.]. // Вестник травматологии и ортопедии. – 2011. – № 2. – С. 26–32.

8. Теоретические и клинические аспекты биорегулирующей терапии в хирургии и травматологии / Б.И. Кузник и [др.]. – Новосибирск: Наука, 2008. – 311 с.

9. Annes J.P. Making sense of latent TGF-beta activation // J.P. Annes, J.S. Munger, D.B. Rifkin // J. Cell. Sci. – 2003. – Vol. 116. – P. 217–224.

10. Balanis N. Mutual cross-talk between fibronectin integrins and the EGF receptor: Molecular basis and biological significance / N. Balanis, C.R. Carlin // Cell Logist. – 2012. – Vol. 2 (1). – P. 46–51.

11. Endres N.F. Regulation of the catalytic activity of the EGF receptor / N.F. Endres, K. Engel, R. Das et al. // Curr. Opin. Struct. Biol. – 2011. – Vol. 21 (6). – P. 777–784.

12. Feng J. Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) and necrotizing enterocolitis / J. Feng, O.N. El-Assal, G.E. Besner // Semin. Pediatr. Surg. – 2005. – Vol. 14 (3). – P. 167–174.

13. Lahti, J.L. Engineered epidermal growth factor mutants with faster binding on-rates correlate with enhanced receptor activation / J.L. Lahti, B.H. Lui, S.E. Beck et al. // FEBS Lett. – 2011. – Vol. 585 (8). – P. 1135–1139.

14. Leahy D.J. Structure and function of the epidermal growth factor (EGF/ErbB) family of receptors // Advances in Protein Chemistry. – 2004. – Vol. 68. – P. 1–27.

15. Muller M.E. The Comprehensive Classifi cation of Fractures of Long Bones / M.E. Muller, S. Nazarian, P. Koch, J. Schtzker // Springer-Verlag Heidelberg – New York, 1996. – 32 p.

16. Radulescu A. Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor overexpression in transgenic mice increases resistance to necrotizing enterocolitis / A. Radulescu, H.Y. Zhang, X. Yu et al. // J. Pediatr. Surg. – 2010. – Vol. 45 (10). – P. 1933–1939.

Актуальность изучения механизмов нарушений консолидации при переломах длинных костей конечностей определяется значительной частотой возникновения данных осложнений, трудностью их лечения и высоким уровнем инвалидности [4, 7]. В последние десятилетия течение многих заболеваний и осложнений, в том числе и нарушений консолидации, значительно изменилось и приобрело скрытый характер, что представляет значительные сложности, как в диагностике, так и в лечении [3].

Доказано, что к одним из основных факторов, определяющих особенности исхода при переломах, относится иммунная система, нарушение которой может приводить к развитию различных осложнений [3, 8]. Иммунные клетки секретируют многочисленные растворимые медиаторы (цитокины), играющие важнейшую роль в различных физиологических и патологических процессах организма. Одними из таких клеточных медиаторов, играющих важную роль в регуляции обменных и восстановительных процессов, являются ростовые факторы – трансформирующий фактор роста β1 (TGF β1) и эпидермальный фактор роста (EGF) [1].

TGFβ1 – это мультипотентный цитокин, являющийся важным модулятором клеточного роста, воспаления, пролиферации и дифференцировки, внеклеточного матричного депонирования и апоптоза [9]. TGFβ1 активирует фибробласты, способствует процессам репарации ран и непосредственно стимулирует ангиогенез [2].

EGF стимулирует пролиферацию фибробластов и влияет на продукцию ими простагландинов, протеогликанов, коллагена, ростовых факторов и ряда цитокинов, включая колониестимулирующие факторы, интерлейкины и интерферон, что в конечном итоге способствует ускорению регенерации раневого процесса [12, 16]. EGF осуществляет свое действие с участием мембранного рецептора – EGFR, который принадлежит к семейству рецепторов ErbB. Рецепторы данного семейства состоят из внеклеточного лиганд-связывающего домена, гидрофобного трансмембранного домена и внутриклеточного домена, обладающего тирозинкиназной активностью и играющего ключевую роль при запуске внутриклеточных путей передачи сигнала [14]. Хотя рецептор EGF был открыт более 30 лет назад, механизм его активации до сих пор не ясен и интенсивно исследуется [10, 11, 13].

Согласно исследованиям последних лет определенная роль в развитии осложнений отводится наследственным факторам. Генетически запрограммированный повышенный или пониженный синтез цитокинов сказывается на способности иммунной системы человека реагировать на разные виды патогенов и на развитии целого ряда иммунопатологических процессов [1]. Однако, несмотря на широкомасштабные исследования генетического полиморфизма регуляторных и адгезивных молекул при различных заболеваниях, почти не коснулись проблем травматологии, в которой патогенез осложнений при травме имеет свои особенности [5].

В связи с вышесказанным изучение генетического полиморфизма цитокинов, принимающих участие в механизмах регуляции межклеточных взаимодействий у больных при травме, а также поиски генетических маркеров развития осложнений представляется перспективным как в теоретическом, так и практическом отношениях.

Цель исследования – изучить частоту встречаемости генотипов полиморфного маркера гена трансформирующего ростового фактора бета-1 (TGFβ1 Arg25Pro) и рецептора в гене эпидермального фактора роста (EGFR A2073T) у пациентов с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей и развитием замедленной консолидации.

Материалы и методы исследования

В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2011 – поправки) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утверждёнными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Проведено обследование 108 пациентов в возрасте от 20 до 40 лет с переломами длинных костей конечностей. Первую группу составили 62 пациента (мужчины – 82,3 %, женщины – 17,7 %) с неосложненным течением переломов (группа клинического сравнения). Вторую группу составили 46 больных (мужчины – 82,6 %, женщины – 17,4 %). У пациентов данной группы в раннем послеоперационном периоде каких-либо осложнений не зарегистрировано, однако в позднем периоде зафиксировано нарушение консолидации переломов по типу замедленной консолидации. Полученные данные сравнивались с результатами исследований, проведенных у 100 практически здоровых доноров в возрасте от 20 до 40 лет. В работе с закрытыми и открытыми переломами использовалась классификация М.Е. Mюллера и соавт. (1996), (табл. 1) [15].

Таблица 1

Распределение больных по характеру и локализации переломов %

Всем пациентам с закрытыми переломами проводилась открытая репозиция отломков с последующим металлоостеосинтезом пластинами или штифтами. Больным с открытыми переломами при поступлении выполнялась первичная хирургическая обработка и наложение аппаратов наружной фиксации. В дальнейшем применялась традиционная консервативная терапия (антибактериальные средства, дезагреганты, местное медикаментозное лечение и др.). Сформированные группы являлись относительно однородными как по возрасту, полу, характеру и локализации переломов, так и по проводимому лечению. Из групп исключались пациенты с какой-либо сопутст вующей патологией.

Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови. Для исследования выбрана точковая мутация TGFβ1 в позиции 25 (Arg > Pro) и мутация рецептора EGFR в позиции 2073 (A > T). Амплификацию фрагмента исследуемых генов проводили в термоцикле (модель Ре «Бис» – М111 (ООО «Бис-Н», Новосибирск). В работе использовались стандартные наборы праймеров научно-производственной фирмы «Литех» – «SNP» (Москва). Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 3 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия в проходящем ультрафиолетовом свете [5].

Полученные данные обработаны с помощью программы «BIOSTAT». Статистический анализ полученных данных проведен с использованием критерия χ2. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05. Для оценки ассоциаций аллелей с генотипом рассчитывали относительный риск (ОР) [6].

Результаты исследования и их обсуждение

Распределение распространенности генотипов полиморфного локуса Arg25Pro гена TGFβ1 и локуса A2073T гена EGFR у больных с неосложненным течением переломов, развитием замедленной консолидации и контрольной группы соответствовало ожидаемому равновесию Харди – Вайнберга.

По данным распределения распространенности аллелей и генотипов гена TGFβ1 Arg25Pro у больных с развитием замедленной консолидации переломов получены достоверные различия как с группой здоровых лиц, так и с группой клинического сравнения (табл. 2, 3).

При этом отмечено, что частота носительства генотипа –25Arg/Arg, –25Arg/Pro и –25Pro/Pro гена TGFβ1, а также аллеля –25Arg– и аллеля –25Pro у больных с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей не отличалась от группы контроля (р = 0,62, р = 0,6 соответственно). Напротив, в группе с развитием замедленной консолидации в позднем периоде травмы регистрировалось достоверно частое обнаружение генотипа –25Pro/Pro и редкое – генотипа –25Arg/Arg гена TGFβ1, не только в сравнении с группой здоровых резидентов, но и с больными с неосложнённым течением переломов (р = 0,0001) (табл. 2, 3).

Таблица 2

Частота генотипов гена TGFβ1-25Arg > Pro и его аллельных вариантов среди здоровых резидентов и пациентов с неосложненным и осложненным (замедленная консолидация) течением переломов длинных костей конечностей (χ2, df = 1)

Примечание. Статистическая значимость различий с контролем.

Таблица 3

Частота аллельных вариантов гена TGFβ1-25Arg > Pro и его генотипов среди пациентов с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей и развитием замедленной консолидации (χ2, df = 1)

Примечание. р – статистическая значимость различий между группами.

Расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию аллеля –25Pro гена TGFβ1 с развитием замедленной консолидации переломов длинных костей (5,33 ДИ [2,95–9,64]). Генотип –25Pro/Pro гена TGFβ1 также ассоциирован с развитием замедленной консолидации (ОР 21,45 при доверительном интервале – ДИ от 5,87 до 78,43), (табл. 3).

Распределение генотипов EGFR-2073A > T и частоты его аллельных вариантов у здоровых лиц и у пациентов с переломами длинных костей представлены в табл. 4 и 5.

Таблица 4

Частота генотипов гена EGFR-2073A > T и его аллельных вариантов среди здоровых резидентов и пациентов с неосложненным и осложненным (замедленная консолидация) течением переломов длинных костей конечностей (χ2, df = 1)

Примечание. Статистическая значимость различий с контролем.

Таблица 5

Частота аллельных вариантов гена EGFR-2073A > T и его генотипов среди пациентов с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей и развитием замедленной консолидации и (χ2, df = 1)

Примечание. р – статистическая значимость различий между группами.

Распространенность генотипов –2073А/А, –2073А/Т и –2073Т/Т гена EGFR оказалась одинаково частой у здоровых лиц и у больных группы клинического сравнения. В то же время генотип –2073Т/Т гена EGFR в 6,3 раза чаще регистрировался у пациентов с нарушением консолидации по типу замедленной консолидации по сравнению со здоровыми лицами (р = 0,0001) и в 5,2 раза чаще, чем у пациентов с неосложненным течением переломов (р = 0,0001). Расчет относительного риска также выявил положительную ассоциацию генотипа –2073Т/Т гена EGFR с развитием замедленной консолидации переломов длинных костей, как с группой контроля, так и группой клинического сравнения (ОР = 11,5, ДИ [4,56–29,01 и ОР = 9,33, ДИ [3,36–25,92] соответственно).

При сравнении частоты аллельных вариантов гена EGFR-2073A > T выявлено, что при замедленной консолидации переломов аллель –2073Т встречается с частотой 0,685, что достоверно чаще, чем у здоровых индивидуумов и пациентов с отсутствием осложнений при переломах (р = 0,0001), а расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию данного аллеля с развитием замедленной консолидации (ОР = 3,33, ДИ [1,88–5,87]) (табл. 4, 5)

Таким образом, определение полиморфизма генов молекул ростовых факторов (TGFβ1-25Arg > Pro, EGFR-2073A > T) у пациентов с переломами длинных костей конечностей дает возможность осуществлять индивидуальный прогноз течения репаративных процессов, что в конечном итоге позволит проводить необходимые персонализированные профилактические мероприятия и значительно увеличить качество жизни пациента.

Выводы

1. Распространенность генотипов полиморфных молекул гена TGFβ1-25Arg > Pro, EGFR-2073A > T и их аллельных вариантов у пациентов с неосложненным течением переломов не отличается от здоровых лиц.

2. Генотип –25Pro/Pro полиморфизма гена TGFβ1 и генотип –2073Т/Т полиморфизма гена EGFR ассоциированы с развитием замедленной консолидации переломов.

Цыбиков Н.Н., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита;

Намоконов Е.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой общей и специализированной хирургии с курсом топографической анатомии и оперативной хирургии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита.

Работа поступила в редакцию 10.12.2014.

Библиографическая ссылка