Высокая токсичность противоопухолевых препаратов ограничивает возможности лечения онкологических заболеваний. Одним из путей решения данной проблемы является повышение избирательности противоопухолевой терапии за счет использования специфических векторов (гормоны, онкофетальные белки, антитела и др.), обладающих тропностью к опухолевым клеткам [4, 6]. В ряде исследований в качестве вектора предлагается использование молекул ДНК [3, 4].
Показано, что экзогенная ДНК размером 50–120 нм избирательно накапливается в ткани опухоли у крыс с перевитой саркомой М-1 [3]. В литературе имеются сведения о создании конъюгатов ряда противоопухолевых химиопрепаратов (доксорубицин, карминомицин) с ДНК in vitro [1, 2, 5]. Однако до настоящего времени антибластомная активность химиопрепаратов при их введении в форме конъюгатов с ДНК мало изучена. Данные обстоятельства и послужили основанием для проведения настоящего исследования.
Цель работы – изучить антибластомную эффективность конъюгатов «ДНК-доксорубицин» и «ДНК-цисплатин» при холангиоцеллюлярной карциноме РС-1 у крыс в эксперименте.
Материалы и методы исследования
В работе использованы следующие препараты: Доксорубицин, «Teva», Израиль; Циплатин, «Teva», Израиль; Деринат, «Техномедсервис», Россия.
Приготовление конъюгатов доксорубицина и цисплатина осуществляли по методике Мельникова Д.Ю. [3] в собственной модификации. В стерильных условиях смешивали 2 мл водного раствора химиопрепарата (доксорубицин в концентрации
12 мг/мл или цисплатин (в концентрации 1 мг/мл) и 1 мл 10 %-го человеческого сывороточного альбумина. Инкубировали 30 минут при 4 °С и непрерывном шейкировании, затем добавляли 2 мл 1,5 % раствора ДНК (препарат «Деринат»), продолжали инкубацию в тех же условиях в течение 60 минут. Свободный химиопрепарат удаляли диализом ацетатным буфером. Степень конъюгации для обоих препаратов составляла 60–70 %.
Для оценки эффективности и безопасности полученных конъюгатов выполнены эксперименты на 72 нелинейных лабораторных крысах. Животным по достижении массы 80-100 г под кожу передней брюшной стенки перевивали штамм холангиоцеллюлярной карциномы РС-1. Животные были разделены на 6 групп, по 12 особей в каждой. В контрольной группе животные лечения не получали. В опытных группах проводилась химиотерапия, которую начинали на 7-й день после перевивки опухоли (табл. 1).
Инъекции производились внутривенно трехкратно с интервалом в 3 суток. На 21-е сутки после начала лечения животных забивали и определяли показатели, характеризующие эффективность химиотерапии: индекс массы опухоли (отношение массы опухоли к массе тела животного); индекс торможения роста опухоли (ИТРО), рассчитываемый по формуле
ИТРО = (Mк – Мо)/Мк∙100,
где Мк и Мо – средняя масса опухоли соответственно в контрольной и опытных группах.
Таблица 1
Схемы проводимой терапии
Группа |
Препарат |
Доза |
Контроль |
– |
– |
1-я опытная |
Водорастворимый доксорубицин |
2 мг/кг |
2-я опытная |
Конъюгат доксорубицин – ДНК |
2 мг/кг (по доксорубицину) |
3-я опытная |
Водорастворимый цисплатин |
2,5 мг/кг |
4-я опытная |
Конъюгат цисплатин –ДНК |
2,5 мг/кг (по цисплатину) |
5-я опытная |
Деринат |
7,5 мг/кг (по ДНК) |
Для оценки побочных и токсических эффектов проводили исследование клеточного состава и биохимических показателей крови. Показатели определяли до начала исследования и на 10-е сутки после начала химиотерапии. Анализ крови, включавший подсчет количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, а также определение концентрации гемоглобина, выполняли на гематологическом анализаторе ABX Micros 60 (Horiba ABX Diagnostics Inc, Франция). Биохимический анализ крови включал определение общего белка, креатинина, билирубина, аланиновой и аспарагиновой трансаминаз (АлТ и АсТ) и креатинфосфокиназы. Биохимические показатели определяли на анализаторе Humalyzer 3000 (Human GmbH, Германия).
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента и критерия хи-квадрат. Критический уровень значимости различий принимался равным 5 % (р < 0,05). По ходу изложения уровни значимости при сравнении показателей обозначены подстрочными индексами: 0 – для контрольной и 1–5 для опытных групп.
Результаты исследования
и их обсуждение
Результаты исследования эффективности различных схем противоопухолевой химиотерапии приведены в табл. 2. В 1-й опытной группе (доксорубицин, 2 мг/кг) индекс массы опухоли был достоверно ниже такового в контроле, составляя 14,5 ± 1,4 % (р0-1 < 0,001); индекс торможения роста опухоли был
равен 67,1 %.
Во 2-й опытной группе (конъюгат «ДНК-доксорубицин», 2 мг/кг) индекс массы опухоли был ниже, чем в контрольной группе, но выше, чем в группе, получавшей водный доксорубицин. Оба различия были статистически значимыми (р0-2 < 0,001, р1-2 < 0,05). ИТРО в данной группе составил 53,2 %, что на 20 % меньше, чем при использовании «чистого» доксорубицина.
Цитостатический эффект цисплатина был более выраженным, чем эффект доксорубицина. В 3-й опытной группе ИМО составил 10,9 ± 1,6 % (р0-3 < 0,001), ИТРО – 75,3 %. При терапии конъюгатом «ДНК-цисплатин» в дозе 2,5 мг/кг ИМО был равен 15,6 ± 2,1 % (р0-4 < 0,001, р3-4 < 0,05). ИТРО составил 64,7 %.
Деринат в виде монотерапии (6-я опытная группа) не оказывал значимого влияния на опухолевый рост.
Результаты исследования гематологических показателей представлены в табл. 3, а биохимических – в табл. 4.
Таблица 2
Противоопухолевая активность различных схем терапии
Группы сравнения |
Значения показателей в группах |
||
ИМО |
ИТРО |
||
Значение |
р |
||
Контрольная |
44,1 ± 3,1 |
– |
– |
1-я опытная («чистый» доксорубицин, 2 мг/кг) |
14,5 ± 1,4 |
р0-1 < 0,001 |
67,1 |
2-я опытная (конъюгат доксорубицин – ДНК, 2 мг/кг) |
20,2 ± 2,7 |
р0-2 < 0,001 р1-2 < 0,05 |
53,2 |
3-я опытная (водорастворимый цисплатин, 2,5 мг/кг) |
10,9 ± 1,6 |
р0-3 < 0,001 |
75,3 |
4-я опытная (конъюгат цисплатин –ДНК, 2,5 мг/кг) |
15,6 ± 2,1 |
р0-4 < 0,001 р3-4 < 0,05 |
64,7 |
5-я опытная (деринат) |
48,1 ± 3,7 |
р0-5 > 0,05 |
–9,1 |
Таблица 3
Изменения гематологических показателей на фоне проводимой терапии
Показатель |
Значение показателей в группах |
||||||
Этап исследования |
Контрольная |
1-я опытная («чистый» доксорубицин, |
2-я опытная (конъюгат доксорубицин – ДНК, 2 мг/кг) |
3-я опытная (водорастворимый цисплатин, 2,5 мг/кг) |
4-я опытная (конъюгат цисплатин – ДНК, |
5-я опытная (ДНК) |
|
Эритроциты |
До |
9,5 ± 3,1 |
10,7 ± 2,2 |
10,3 ± 1,8 |
11,0 ± 3,2 |
11,9 ± 2,6 |
10,8 ± 2,4 |
10 сут |
8,5 ± 2,1 p* > 0,05 |
9,7 ± 1,2 p > 0,05 |
10,8 ± 2,0 p > 0,05 |
8,1 ± 2,1 p > 0,05 |
9,7 ± 1,1 p > 0,05 |
9,8 ± 2,0 p > 0,05 |
|
Лейкоциты |
До перевивки |
10,9 ± 1,4 |
11,7 ± 1,6 |
11,6 ± 1,5 |
10,5 ± 0,8 |
11,2 ± 1,2 |
10,4 ± 2,2 |
10 сут |
15,8 ± 2,2 р < 0,05 |
8,5 ± 0,9 р < 0,05 |
10,7 ± 0,9 р < 0,05 |
4,2 ± 0,5 р < 0,001 |
5,9 ± 0,6 р < 0,001 |
9,1 ± 0,4 p > 0,05 |
|
Тромбоциты |
До перевивки |
334 ± 12 |
341 ± 16 |
291 ± 11 |
279 ± 16 |
259 ± 20 |
305 ± 26 |
10 сут |
320 ± 14 p > 0,05 |
225 ± 19 р < 0,001 |
264 ± 24 р < 0,05 |
104 ± 21 р < 0,001 |
123 ± 13 р < 0,001 |
279 ± 17 p > 0,05 |
Примечание. * в данной таблице приведен уровень значимости при сравнении показателей на исходном этапе (до перевивки опухоли) и на 10-е сутки после начала химиотерапии.
У нелеченных животных развитие опухоли сопровождалось умеренно выраженным лейкоцитозом, регистрировалось снижение общего белка сыворотки. Биохимические показатели, характеризующие функциональное состояние почек (креатинин) и печени (билирубин, АлТ, АсТ), значимо не изменялись.
Проведение химиотерапии во всех группах сопровождалось типичными для исследуемых препаратов реакциями кроветворной системы – лейко- и тромбоцитопенией. Для животных, получавших доксорубицин, было типичным повышение кардиоспецифических ферментов. В группах, получавших химиотерапию цисплатином и его ДНК-конъюгатом, регистрировалось статистически значимое увеличение концентрации креатинина. Другие биохимические показатели значимо не изменялись.
В целом степень выраженности токсических реакций при введении конъюгированных с ДНК форм исследованных препаратов была меньшей, чем при терапии «чистыми» препаратами.
Так, в группе животных, получавших водный доксорубицин, снижение числа лейкоцитов и тромбоцитов по сравнению с исходным этапом составило соответственно 27 % (р < 0,05) и 34 % (р < 0,001), а при химиотерапии ДНК-конъюгированным доксорубицином – 8,5 и 9,2 % (р < 0,05).
Таблица 4
Изменения биохимических показателей на фоне проводимой терапии
Показатель |
Значение показателей в группах |
||||||
Этап исследования |
Контрольная |
1-я опытная («чистый» доксорубицин, |
2-я опытная (конъюгат доксорубицин – ДНК, 2 мг/кг) |
3-я опытная (водорастворимый цисплатин, 2,5 мг/кг) |
4-я опытная (конъюгат цисплатин – |
5-я опытная (ДНК) |
|
Общий белок |
До перевивки |
89 ± 7,1 |
84,5 ± 4,5 |
76,3 ± 5,9 |
87,4 ± 7,3 |
79,2 ± 7,0 |
83 ± 6,8 |
10 сут |
69 ± 5,1 p* < 0,05 |
70,7 ± 6,0 р < 0,05 |
75,4 ± 8,0 p > 0,05 |
70,4 ± 7,1 р < 0,05 |
78,5 ± 8,0 p > 0,05 |
79,3 ± 7,9 p > 0,05 |
|
Креатинин |
До перевивки |
0,061 ± 0,007 |
0,074 ± 0,006 |
0,079 ± 0,008 |
0,054 ± 0,01 |
0,051 ± 0,05 |
0,075 ± 0,08 |
10 сут |
0,059 ± 0,007 p > 0,05 |
0,085 ± 0,012 p > 0,05 |
0,087 ± 0,012 p > 0,05 |
0,197 ± 0,02 р < 0,001 |
0,169 ± 0,01 р < 0,001 |
0,087 ± 0,021 p > 0,05 |
|
Билирубин |
До перевивки |
11,3 ± 1,1 |
16,3 ± 1,2 |
14,8 ± 1,7 |
9,9 ± 1,1 |
10,7 ± 0,5 |
12,2 ± 2,2 |
10 сут |
10,4 ± 1,4 p > 0,05 |
18,8 ± 2,4 р < 0,05 |
17,8 ± 1,4 р < 0,05 |
14,0 ± 2,3 р < 0,001 |
10,5 ± 1,7 p > 0,05 |
16,7 ± 3,0 р < 0,05 |
|
АлТ |
До перевивки |
34,5 ± 5,2 |
36,7 ± 2,2 |
36,3 ± 1,0 |
37,6 ± 2,8 |
39,1 ± 2,5 |
34,4 ± 2,7 |
10 сут |
30,9 ± 2,2 p > 0,05 |
41,5 ± 1,7 р < 0,05 |
39,4 ± 0,6 р < 0,05 |
42,4 ± 0,9 р < 0,05 |
40,1 ± 4,0 p > 0,05 |
34,7 ± 4,2 p > 0,05 |
|
АсТ |
До перевивки |
30,3 ± 5,0 |
35,9 ± 4,0 |
31,7 ± 3,0 |
34,2 ± 0,1 |
37,7 ± 4,0 |
32,5 ± 3,0 |
10 сут |
32,2 ± 2,8 p > 0,05 |
39,7 ± 4,7 p > 0,05 |
34,9 ± 4,3 p > 0,05 |
40,2 ± 0,6 р < 0,05 |
38,7 ± 4,2 p > 0,05 |
35,0 ± 3,7 p > 0,05 |
|
КФК |
До перевивки |
10,1 ± 1,2 |
11,4 ± 1,8 |
13,1 ± 1,5 |
12,6 ± 1,2 |
11,8 ± 0,9 |
12,2 ± 2,1 |
10 сут |
11,1 ± 1,1 p > 0,05 |
38,1 ± 1,1 р < 0,001 |
22,4 ± 1,3 р < 0,001 |
13,7 ± 1,0 p > 0,05 |
14,1 ± 1,1 p > 0,05 |
13,2 ± 1,1 p > 0,05 |
Примечание. * в данной таблице приведен уровень значимости при сравнении показателей на исходном этапе (до перевивки опухоли) и на 10-е сутки после начала химиотерапии.
В группе, где проводилось лечение ДНК-конъюгированным цисплатином, наиболее значимым было уменьшение нефротоксичности. На фоне введения водного раствора цисплатина к 10-м суткам концентрация креатинина увеличилась на 264 % (р < 0,001), тогда как при терапии ДНК-конъюгированным цисплатином – на 85 % (р < 0,001).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что конъюгация с ДНК приводит к некоторому снижению противоопухолевой активности, но вместе с тем и уменьшает токсичность рассмотренных цитостатиков. Рамки данного исследования не позволяют определить, какой из вышеозначенных эффектов является преобладающим, что диктует необходимость определения эквитоксических доз для водорастворимых и ДНК-конъюгированных форм препаратов.
Работа выполнена при поддержке Минобрнауки РФ в рамках Госзадания
ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева», проект № 53/3-14.
Инчина В.И., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой фармакологии и клинической фармакологии с курсом фармацевтической технологии, ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва», г. Саранск;
Зырянов С.К., д.м.н., профессор кафедры клинической фармакологии, ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава РФ, г. Москва.
Работа поступила в редакцию 10.11.2014.