Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДНК-КОНЪЮГИРОВАННЫХ ФОРМ ДОКСОРУБИЦИНА И ЦИСПЛАТИНА ПРИ ХОЛАНГИОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЕ У КРЫС

Пятаев Н.А. 1 Минаева О.В. 1 Зырняева Н.Н. 1 Кокорев А.В. 1 Гуревич К.Г. 2 Заборовский А.В. 2 Щукин С.А. 1
1 ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва»
2 ГБОУ ВПО «MГМСУ им. А.И. Евдокимова»
Изучена эффективность химиотерапии конъюгатами «ДНК-доксорубицин» и «ДНК-цисплатин» у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1. Противоопухолевая активность оценивалась по индексу массы опухоли и индексу торможения роста опухоли. Контролем служили животные без лечения и животные, получавшие препарат ДНК без цитостатика. Для оценки побочных эффектов исследовали гематологические и биохимические показатели крови. Показано, что при введении в эквимолярных дозах конъюгированные с ДНК формы доксорубицина и цисплатина обладают меньшей антибластомной активностью, чем водорастворимые формы этих препаратов. Изолированная ДНК не оказывала противоопухолевого эффекта. Установлено, что токсические эффекты на фоне химиотерапии конъюгатами «ДНК-доксорубицин» и «ДНК-цисплатин» развиваются реже, чем при применении водорастворимых форм этих препаратов. Для конъюгата «ДНК-доксорубицин» характерно уменьшение миело- и кардиотоксичности, для конъюгата «ДНК-цисплатин» – снижение нефротоксичности.
доксорубицин
цисплатин
ДНК
холангиоцеллюлярная карцинома РС-1
1. Вайнберг Ю.П. Физико-химические и биологические свойства комплекса ДНК с карминомицином // Медицина. – 1980. – № 9. – С. 18–22.
2. Мельников Д.Ю. Применение иммуноконъюгатов в химиотерапии онкологических больных // Медицинская картотека. – 1999. – № 7–8. – С. 28–32.
3. Пятаев Н.А. Особенности тканевого распределения и противоопухолевой активности доксорубицина при введении в форме конъюгата с ДНК у крыс с трансплантированной карциномой РС-1 / Н.А. Пятаев, П.И. Скопин, О.В. Минаева, С.А. Щукин, Е.Ю. Коровина, Н.Н. Зырняева // Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т. 10. – № 2. – С. 55–59.
4. Русинова Г.Г. Особенности усвоения экзогенной ДНК и ее низкомолекулярных предшественников в организме животных // Биохимия. – 1971. – Т.36. – № 5. – С. 88–89.
5. Bellini M. Protein Nanocages for Self-Triggered Nuclear Delivery of DNA-Targeted Chemotherapeutics in Cancer Cells / M. Bellini, S. Mazzucchelli, E. Galbiati, S. Sommaruga, L. Fiandra, M. Truffi, M.A. Rizzuto, M. Colombo, P. Tortora, F. Corsi, D. Prosperi // J. Control Release. – 2014. – Vol. 3. – P. 75–85.
6. Deprez-De Campeneere D. Comparative study in mice of the toxicity, pharmacology, and therapeutic activity of daunorubicin-DNA and doxorubicin-DNA complexes / Deprez-De Campeneere D., R. Baurain, M. Huybrechts, A. Trouet // Cancer Chemother. Pharmacol. – 1979. – Vol. 2. – № 1. – P.25–30.
7. Mickan A. Rational Design of CPP-based Drug Delivery Systems: Considerations from Pharmacokinetics / A. Mickan, D. Sarko, U. Haberkorn, W. Mier // Curr. Pharm. Biotechnol. – 2014. – Vol. 15(3). – Р. 200–209.
8. Severin S.E. Antitumor activity of conjugates of the oncofetal protein alpha-fetoprotein and phthalocyanines in vitro // Biochemistry and Molecular Biology International. – 1997. – Т. 43. – № 4. – P. 873–881.
9. Shin M.C. Cell-penetrating peptides: achievements and challenges in application for cancer treatment / M.C. Shin, J. Zhang, K.A. Min, K. Lee, Y. Byun, A.E. David, H.He, V.C. Yang // J. Biomed. Mater. Res. – 2014. – Vol. 102(2). – Р. 575– 587.

Высокая токсичность противоопухолевых препаратов ограничивает возможности лечения онкологических заболеваний. Одним из путей решения данной проблемы является повышение избирательности противоопухолевой терапии за счет использования специфических векторов (гормоны, онкофетальные белки, антитела и др.), обладающих тропностью к опухолевым клеткам [4, 6]. В ряде исследований в качестве вектора предлагается использование молекул ДНК [3, 4].
Показано, что экзогенная ДНК размером 50–120 нм избирательно накапливается в ткани опухоли у крыс с перевитой саркомой М-1 [3]. В литературе имеются сведения о создании конъюгатов ряда противоопухолевых химиопрепаратов (доксорубицин, карминомицин) с ДНК in vitro [1, 2, 5]. Однако до настоящего времени антибластомная активность химиопрепаратов при их введении в форме конъюгатов с ДНК мало изучена. Данные обстоятельства и послужили основанием для проведения настоящего исследования.

Цель работы – изучить антибластомную эффективность конъюгатов «ДНК-доксорубицин» и «ДНК-цисплатин» при холангиоцеллюлярной карциноме РС-1 у крыс в эксперименте.

Материалы и методы исследования

В работе использованы следующие препараты: Доксорубицин, «Teva», Израиль; Циплатин, «Teva», Израиль; Деринат, «Техномедсервис», Россия.

Приготовление конъюгатов доксорубицина и цисплатина осуществляли по методике Мельникова Д.Ю. [3] в собственной модификации. В стерильных условиях смешивали 2 мл водного раствора химиопрепарата (доксорубицин в концентрации
12 мг/мл или цисплатин (в концентрации 1 мг/мл) и 1 мл 10 %-го человеческого сывороточного альбумина. Инкубировали 30 минут при 4 °С и непрерывном шейкировании, затем добавляли 2 мл 1,5 % раствора ДНК (препарат «Деринат»), продолжали инкубацию в тех же условиях в течение 60 минут. Свободный химиопрепарат удаляли диализом ацетатным буфером. Степень конъюгации для обоих препаратов составляла 60–70 %.

Для оценки эффективности и безопасности полученных конъюгатов выполнены эксперименты на 72 нелинейных лабораторных крысах. Животным по достижении массы 80-100 г под кожу передней брюшной стенки перевивали штамм холангиоцеллюлярной карциномы РС-1. Животные были разделены на 6 групп, по 12 особей в каждой. В контрольной группе животные лечения не получали. В опытных группах проводилась химиотерапия, которую начинали на 7-й день после перевивки опухоли (табл. 1).

Инъекции производились внутривенно трехкратно с интервалом в 3 суток. На 21-е сутки после начала лечения животных забивали и определяли показатели, характеризующие эффективность химиотерапии: индекс массы опухоли (отношение массы опухоли к массе тела животного); индекс торможения роста опухоли (ИТРО), рассчитываемый по формуле

ИТРО = (Mк – Мо)/Мк∙100,

где Мк и Мо – средняя масса опухоли соответственно в контрольной и опытных группах.

Таблица 1

Схемы проводимой терапии

Группа

Препарат

Доза

Контроль

1-я опытная

Водорастворимый доксорубицин

2 мг/кг

2-я опытная

Конъюгат доксорубицин – ДНК

2 мг/кг (по доксорубицину)

3-я опытная

Водорастворимый цисплатин

2,5 мг/кг

4-я опытная

Конъюгат цисплатин –ДНК

2,5 мг/кг (по цисплатину)

5-я опытная

Деринат

7,5 мг/кг (по ДНК)

Для оценки побочных и токсических эффектов проводили исследование клеточного состава и биохимических показателей крови. Показатели определяли до начала исследования и на 10-е сутки после начала химиотерапии. Анализ крови, включавший подсчет количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, а также определение концентрации гемоглобина, выполняли на гематологическом анализаторе ABX Micros 60 (Horiba ABX Diagnostics Inc, Франция). Биохимический анализ крови включал определение общего белка, креатинина, билирубина, аланиновой и аспарагиновой трансаминаз (АлТ и АсТ) и креатинфосфокиназы. Биохимические показатели определяли на анализаторе Humalyzer 3000 (Human GmbH, Германия).

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента и критерия хи-квадрат. Критический уровень значимости различий принимался равным 5 % (р < 0,05). По ходу изложения уровни значимости при сравнении показателей обозначены подстрочными индексами: 0 – для контрольной и 1–5 для опытных групп.

Результаты исследования
и их обсуждение

Результаты исследования эффективности различных схем противоопухолевой химиотерапии приведены в табл. 2. В 1-й опытной группе (доксорубицин, 2 мг/кг) индекс массы опухоли был достоверно ниже такового в контроле, составляя 14,5 ± 1,4 % (р0-1 < 0,001); индекс торможения роста опухоли был
равен 67,1 %.

Во 2-й опытной группе (конъюгат «ДНК-доксорубицин», 2 мг/кг) индекс массы опухоли был ниже, чем в контрольной группе, но выше, чем в группе, получавшей водный доксорубицин. Оба различия были статистически значимыми (р0-2 < 0,001, р1-2 < 0,05). ИТРО в данной группе составил 53,2 %, что на 20 % меньше, чем при использовании «чистого» доксорубицина.

Цитостатический эффект цисплатина был более выраженным, чем эффект доксорубицина. В 3-й опытной группе ИМО составил 10,9 ± 1,6 % (р0-3 < 0,001), ИТРО – 75,3 %. При терапии конъюгатом «ДНК-цисплатин» в дозе 2,5 мг/кг ИМО был равен 15,6 ± 2,1 % (р0-4 < 0,001, р3-4 < 0,05). ИТРО составил 64,7 %.

Деринат в виде монотерапии (6-я опытная группа) не оказывал значимого влияния на опухолевый рост.

Результаты исследования гематологических показателей представлены в табл. 3, а биохимических – в табл. 4.

Таблица 2

Противоопухолевая активность различных схем терапии

Группы сравнения

Значения показателей в группах

ИМО

ИТРО

Значение

р

 

Контрольная

44,1 ± 3,1

1-я опытная («чистый» доксорубицин, 2 мг/кг)

14,5 ± 1,4

р0-1 < 0,001

67,1

2-я опытная (конъюгат доксорубицин – ДНК, 2 мг/кг)

20,2 ± 2,7

р0-2 < 0,001

р1-2 < 0,05

53,2

3-я опытная (водорастворимый цисплатин, 2,5 мг/кг)

10,9 ± 1,6

р0-3 < 0,001

75,3

4-я опытная (конъюгат цисплатин –ДНК, 2,5 мг/кг)

15,6 ± 2,1

р0-4 < 0,001

р3-4 < 0,05

64,7

5-я опытная (деринат)

48,1 ± 3,7

р0-5 > 0,05

–9,1

 

Таблица 3

Изменения гематологических показателей на фоне проводимой терапии

Показатель

Значение показателей в группах

Этап исследования

Контрольная

1-я опытная («чистый» доксорубицин,
2 мг/кг)

2-я опытная (конъюгат док­со­ру­бицин – ДНК, 2 мг/кг)

3-я опытная (водорастворимый цисплатин, 2,5 мг/кг)

4-я опытная (конъюгат цисплатин – ДНК,
2,5 мг/кг)

5-я опытная (ДНК)

Эритроциты

До
перевивки

9,5 ± 3,1

10,7 ± 2,2

10,3 ± 1,8

11,0 ± 3,2

11,9 ± 2,6

10,8 ± 2,4

10 сут

8,5 ± 2,1

p* > 0,05

9,7 ± 1,2

p > 0,05

10,8 ± 2,0

p > 0,05

8,1 ± 2,1

p > 0,05

9,7 ± 1,1

p > 0,05

9,8 ± 2,0

p > 0,05

Лейкоциты

До

перевивки

10,9 ± 1,4

11,7 ± 1,6

11,6 ± 1,5

10,5 ± 0,8

11,2 ± 1,2

10,4 ± 2,2

10 сут

15,8 ± 2,2

р < 0,05

8,5 ± 0,9

р < 0,05

10,7 ± 0,9

р < 0,05

4,2 ± 0,5

р < 0,001

5,9 ± 0,6

р < 0,001

9,1 ± 0,4

p > 0,05

Тромбоциты

До

перевивки

334 ± 12

341 ± 16

291 ± 11

279 ± 16

259 ± 20

305 ± 26

10 сут

320 ± 14

p > 0,05

225 ± 19

р < 0,001

264 ± 24

р < 0,05

104 ± 21

р < 0,001

123 ± 13

р < 0,001

279 ± 17

p > 0,05

 

Примечание. * в данной таблице приведен уровень значимости при сравнении показателей на исходном этапе (до перевивки опухоли) и на 10-е сутки после начала химиотерапии.

У нелеченных животных развитие опухоли сопровождалось умеренно выраженным лейкоцитозом, регистрировалось снижение общего белка сыворотки. Биохимические показатели, характеризующие функциональное состояние почек (креатинин) и печени (билирубин, АлТ, АсТ), значимо не изменялись.

Проведение химиотерапии во всех группах сопровождалось типичными для исследуемых препаратов реакциями кроветворной системы – лейко- и тромбоцитопенией. Для животных, получавших доксорубицин, было типичным повышение кардиоспецифических ферментов. В группах, получавших химиотерапию цисплатином и его ДНК-конъюгатом, регистрировалось статистически значимое увеличение концентрации креатинина. Другие биохимические показатели значимо не изменялись.

В целом степень выраженности токсических реакций при введении конъюгированных с ДНК форм исследованных препаратов была меньшей, чем при терапии «чистыми» препаратами.

Так, в группе животных, получавших водный доксорубицин, снижение числа лейкоцитов и тромбоцитов по сравнению с исходным этапом составило соответственно 27 % (р < 0,05) и 34 % (р < 0,001), а при химиотерапии ДНК-конъюгированным доксорубицином – 8,5 и 9,2 % (р < 0,05).

Таблица 4

Изменения биохимических показателей на фоне проводимой терапии

Показатель

Значение показателей в группах

Этап исследования

Контрольная

1-я опытная («чистый» доксорубицин,
2 мг/кг)

2-я опытная (конъюгат док­со­ру­би­цин – ДНК, 2 мг/кг)

3-я опытная (водорастворимый цисплатин, 2,5 мг/кг)

4-я опытная (конъюгат цисплатин –
ДНК,
2,5 мг/кг)

5-я опытная (ДНК)

Общий белок

До

перевивки

89 ± 7,1

84,5 ± 4,5

76,3 ± 5,9

87,4 ± 7,3

79,2 ± 7,0

83 ± 6,8

10 сут

69 ± 5,1

p* < 0,05

70,7 ± 6,0

р < 0,05

75,4 ± 8,0

p > 0,05

70,4 ± 7,1

р < 0,05

78,5 ± 8,0

p > 0,05

79,3 ± 7,9

p > 0,05

Креатинин

До

перевивки

0,061 ± 0,007

0,074 ± 0,006

0,079 ± 0,008

0,054 ± 0,01

0,051 ± 0,05

0,075 ± 0,08

10 сут

0,059 ± 0,007

p > 0,05

0,085 ± 0,012

p > 0,05

0,087 ± 0,012

p > 0,05

0,197 ± 0,02

р < 0,001

0,169 ± 0,01

р < 0,001

0,087 ± 0,021

p > 0,05

Билирубин

До

перевивки

11,3 ± 1,1

16,3 ± 1,2

14,8 ± 1,7

9,9 ± 1,1

10,7 ± 0,5

12,2 ± 2,2

10 сут

10,4 ± 1,4

p > 0,05

18,8 ± 2,4

р < 0,05

17,8 ± 1,4

р < 0,05

14,0 ± 2,3

р < 0,001

10,5 ± 1,7

p > 0,05

16,7 ± 3,0

р < 0,05

АлТ

До

перевивки

34,5 ± 5,2

36,7 ± 2,2

36,3 ± 1,0

37,6 ± 2,8

39,1 ± 2,5

34,4 ± 2,7

10 сут

30,9 ± 2,2

p > 0,05

41,5 ± 1,7

р < 0,05

39,4 ± 0,6

р < 0,05

42,4 ± 0,9

р < 0,05

40,1 ± 4,0

p > 0,05

34,7 ± 4,2

p > 0,05

АсТ

До

перевивки

30,3 ± 5,0

35,9 ± 4,0

31,7 ± 3,0

34,2 ± 0,1

37,7 ± 4,0

32,5 ± 3,0

10 сут

32,2 ± 2,8

p > 0,05

39,7 ± 4,7

p > 0,05

34,9 ± 4,3

p > 0,05

40,2 ± 0,6

р < 0,05

38,7 ± 4,2

p > 0,05

35,0 ± 3,7

p > 0,05

КФК

До

перевивки

10,1 ± 1,2

11,4 ± 1,8

13,1 ± 1,5

12,6 ± 1,2

11,8 ± 0,9

12,2 ± 2,1

10 сут

11,1 ± 1,1

p > 0,05

38,1 ± 1,1

р < 0,001

22,4 ± 1,3

р < 0,001

13,7 ± 1,0

p > 0,05

14,1 ± 1,1

p > 0,05

13,2 ± 1,1

p > 0,05

 

Примечание. * в данной таблице приведен уровень значимости при сравнении показателей на исходном этапе (до перевивки опухоли) и на 10-е сутки после начала химиотерапии.

В группе, где проводилось лечение ДНК-конъюгированным цисплатином, наиболее значимым было уменьшение нефротоксичности. На фоне введения водного раствора цисплатина к 10-м суткам концентрация креатинина увеличилась на 264 % (р < 0,001), тогда как при терапии ДНК-конъюгированным цисплатином – на 85 % (р < 0,001).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что конъюгация с ДНК приводит к некоторому снижению противоопухолевой активности, но вместе с тем и уменьшает токсичность рассмотренных цитостатиков. Рамки данного исследования не позволяют определить, какой из вышеозначенных эффектов является преобладающим, что диктует необходимость определения эквитоксических доз для водорастворимых и ДНК-конъюгированных форм препаратов.

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки РФ в рамках Госзадания
ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева», проект № 53/3-14.

Рецензенты:

Инчина В.И., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой фармакологии и клинической фармакологии с курсом фармацевтической технологии, ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва», г. Саранск;

Зырянов С.К., д.м.н., профессор кафедры клинической фармакологии, ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава РФ, г. Москва.

Работа поступила в редакцию 10.11.2014.


Библиографическая ссылка

Пятаев Н.А., Минаева О.В., Зырняева Н.Н., Кокорев А.В., Гуревич К.Г., Заборовский А.В., Щукин С.А. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДНК-КОНЪЮГИРОВАННЫХ ФОРМ ДОКСОРУБИЦИНА И ЦИСПЛАТИНА ПРИ ХОЛАНГИОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЕ У КРЫС // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 10-5. – С. 959-963;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35773 (дата обращения: 23.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074