Проблема лекарственной устойчивости (ЛУ) микобактерий туберкулеза (МБТ) к противотуберкулезным препаратам (ПТП) приобрела в последнее время глобальное значение [6, 9]. Клиническое излечение у впервые выявленных больных с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) МБТ остается низким и составляет 34,6 %, что в три раза ниже уровня клинического излечения туберкулеза у больных с лекарственно чувствительным возбудителем туберкулеза [6].
Необходимость персонализированного подхода к выбору тактики лечения больного, основанного на получении своевременной и достоверной информации о клинически значимых биологических свойствах выделенного от него возбудителя туберкулеза, не вызывает сомнений. Однако вследствие снижения интенсивности бактериовыделения и жизнеспособности МБТ на этапах терапевтического лечения пациента или его исходной олигобактериальности традиционные методы выделения возбудителя из мокроты больного в значительной части случаев недостаточно информативны [3, 7]. Классические бактериологические методы обнаружения, идентификации и определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) МБТ длительны и весьма ресурсоемки. В связи с этим в последние годы приоритет отдается применению современных молекулярно-генетических методов, направленных на решение этих задач [2, 4].
Свойства возбудителя непосредственно в очагах туберкулезного поражения остаются малоизученными. Бактериологическое исследование резецированного участка легкого определяется необходимостью проведения послеоперационного курса химиотерапии у больного с учетом данных о возбудителе и его ЛЧ к ПТП [5, 8]. Очевидно, что комплексное лабораторное исследование резецированного участка, пораженного туберкулезом легкого, дает более полные сведения об особенностях патологического процесса, возбудителе заболевания, его видовой принадлежности и чувствительности к ПТП.
Цель исследования: провести сравнительный анализ клинически значимых биологических свойств (массивность и скорость роста, лекарственная чувствительность, генотипические особенности) Mycobacterium tuberculosis, выделенных из резецированных участков легких и респираторного материала.
Материалы и методы исследования
Культуральными и молекулярно-генетическими методами исследовали двукратно мокроту и/или промывные воды бронхов (n = 219) (при возможности получения материала) непосредственно перед операцией и резецированные участки легких (n = 291) больных, перенесших хирургический этап лечения туберкулеза легких в УНИИ фтизиопульмонологии.
Всего было исследовано 510 образцов биологического материала и 102 культуры МБТ, полученных от 291 больного различными клиническими формами туберкулеза легких. У 259 (89,0 % (95 % ДИ 84,8–92,4 %)) больных туберкулезом легких был установлен диагноз «туберкулема легкого», у остальных 32 (11,0 % (95 % ДИ 7,7–15,2 %)) – «кавернозный» и «фиброзно-кавернозный туберкулез легких».
Культуральное исследование включало посев деконтаминированных осадков мокроты, промывных вод бронхов и гомогенизированных кусочков операционного материала на плотную питательную среду Левенштейна – Йенсена («Himedia Laboratories», Индия) с последующим определением ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций. Культуры M. tuberculosis по чувствительности к основным ПТП делили на ЛЧ и ЛУ в соответствии с приказом МЗ РФ № 109 от 21.03.2003 г. (концентрация изониазида – 1 мкг/мл, рифампицина – 40 мкг/мл, этамбутола – 2 мкг/мл, стрептомицина – 10 мкг/мл, канамицина – 30 мкг/мл).
Скорость роста рассматривали как интервал времени от посева до появления роста в пробирках. Появление колоний МБТ в срок до 30 дней считали быстрым ростом, от 30 до 50 дней – замедленным, свыше 50 дней – медленным ростом. Массивность роста – число колоний, выросших в пробирке. Скудным рост считали при массивности до 20 колоний (1+), умеренным – 21–100 колоний (2+), обильным – свыше 100 колоний (3+).
Обработку первичного материала для выделения ДНК проводили коммерческим набором «ДНК-сорб-В» («Амплисенс», Россия). Операционный материал предварительно гомогенизировали. Для амплификации специфической нуклеотидной последовательности IS6110 геномного материала методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в «режиме реального времени» использовали тест-систему «АмплиСенс®MTC-FL» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) и амплификатор iCycler iQ5 (Bio-Rad, США).
Для молекулярно-генетического исследования мутаций ЛУ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам был использован метод гибридизации с флуоресцентным изображением на биологическом микрочипе «ТБ-БИОЧИП®» и «ТБ-БИОЧИП®-2» (ООО «Биочип-ИМБ», Москва). Анализ результатов гибридизации проводили на приборе «Чипдетектор-01» с использованием специализированного программного обеспечения «Imageware» (ООО «Биочип-ИМБ», Москва).
Методом MIRU-VNTR типирования было исследовано 18 культур МБТ, полученных от 7 больных (7 изолятов, выделенных из операционного материала, и 11 изолятов, выделенных из респираторного материала этих же больных). Изоляты были генотипированы с использованием 7 локусов: MIRU10, MIRU26, MIRU31, Mtub21, ETRA, QUB26, QUB11b. Для постановки ПЦР использовали реактивы производства «Интерлабсервис» (Москва) и праймеры для ПЦР ООО «Синтол» (Москва). Принадлежность к генетической линии определяли путем сравнения полученных MIRU-VNTR профилей изолятов с имеющимися в базе данных «MIRU-VNTRplus» [1].
Результаты проведенных исследований статистически обработаны с использованием лицензионной компьютерной программы MedCalc® V12.6.1 (MedCalc Software, Бельгия). Для всех статистических критериев ошибка первого рода устанавливалась равной 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
При сравнительном анализе биологических свойств МБТ, полученных из различного материала, было установлено, что скорость роста МБТ (n = 37), выделенных из респираторного материала, составила 59 (15) суток; скорость роста МБТ (n = 65), выделенных из операционного материала, составила 56 (17) суток. Максимальный срок появления роста культур – 88 суток, минимальный – 21 сутки. В скорости роста культур МБТ, выделенных из респираторного и операционного материала, статистических различий не найдено (р = 0,261).
Вместе с тем массивность роста культур МБТ, полученных из респираторного и операционного материала, статистически различалась (р = 0,01). При посеве резецированных участков легких в 40,0 % (95 % ДИ 28,0–52,9 %) (26 из 65) случаев отмечали умеренный рост, в 36,9 % (95 % ДИ 25,3–49,8 %) (24 из 65) – обильный, в 23,1 % (95 % ДИ 13,5–35,2 %) (15 из 65) – скудный. При посеве респираторного материала скудный рост отмечали в 69,4 % (95 % ДИ 51,8–83,6 %) (26 из 37) случаев, обильный – 19,5 % (95 % ДИ 8,2–36,1 %) (7 из 37), умеренный – 11,1 % (95 % ДИ 3,1–26,0 %) (4 из 37). Это, по-видимому, можно объяснить тем, что в операционном материале содержится большее количество МБТ, чем в респираторном материале.
Лекарственная чувствительность МБТ была определена методом абсолютных концентраций в 18,8 % (95 % ДИ 13,6–25,0 %) (37 из 197) образцов респираторного материала и в 22,3 % (95 % ДИ 17,6–27,5 %) (65 из 291) образцов операционного материала. С помощью метода биочипов было определено наличие или отсутствие мутаций, обуславливающих лекарственную устойчивость к ПТП, в геноме МБТ в 7,5 % (95 % ДИ 3,9–12,7 %) (12 из 161) образцов респираторного материала и в 95,9 % (95 % ДИ 92,3–97,9 %) (279 из 291) образцов операционного материала.
Сравнительный анализ ЛЧ МБТ, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения методом абсолютных концентраций, удалось провести у 19 больных.
При сопоставлении результатов определения ЛЧ МБТ из резецированных участков легких (n = 19), с результатами ЛЧ МБТ из респираторного материала (n = 23), полученных от одних и тех же пациентов (n = 19) на хирургическом этапе лечения, методом абсолютных концентраций совпадение составило 100,0 %.
У всех 19 больных были выявлены культуры МБТ с ЛУ. У 8 (42,1 % (95 % ДИ 20,2–66,5 %)) пациентов были найдены МБТ с ЛУ к пяти ПТП (изониазиду, рифампицину, этамбутолу, стрептомицину и канамицину). У 6 (31,5 % (95 % ДИ 12,5–56,5 %)) больных были выявлены МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину, этамбутолу и стрептомицину. 2 (10,5 % (95 % ДИ 1,3–33,1 %)) пациента имели МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину, этамбутолу и канамицину. Культуры МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину, этамбутолу и канамицину, а также культуры МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину и стрептомицину были получены от 1 (5,3 % (95 % ДИ 0,13–26,1 %)) больного каждая. Таким образом, у 18 (94,7 % (95 % ДИ 73,9–99,9 %)) больных были обнаружены ЛУ МБТ к 2 основным ПТП I ряда (изониазиду и рифампицину), то есть имели МЛУ МБТ. Еще от 1 (5,3 % (95 % ДИ 0,13–26,1 %)) больного была получена культура МБТ с ЛУ к изониазиду, этамбутолу, стрептомицину и канамицину.
Сравнительный анализ результатов определения наличия или отсутствия мутаций, обуславливающих ЛУ, в геноме МБТ, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения, методом биочипов удалось провести только у 11 больных.
При сравнении результатов определения наличия или отсутствия мутаций в геноме МБТ, выделенных из респираторного материала (n = 12), с результатами определения наличия или отсутствия мутаций в геноме МБТ, полученных из резецированных участков легких (n = 11) одних и тех же пациентов (n = 11), методом биочипов совпадение составило 100,0 %.
У 1 (9,1 % (95 % ДИ 0,2–41,3 %)) из 12 больных и в респираторном, и в операционном материале была обнаружена ДНК МБТ, не содержащая мутаций в генах rpoB, katG, inhA, промоторной области ahp-oxyR и gyrA, в материале 10 (90,9 % (95 % ДИ 58,7–99,8 %)) больных выявлялись мутации в указанных генах МБТ. В 9,1 % (95 % ДИ 0,2–41,3 %) (1 из 11) случаев были обнаружены моноустойчивые МБТ, которые имели мутации в гене inhA, отвечающие за ЛУ к изониазиду. Сочетание мутаций в генах, ответственных за МЛУ МБТ, было обнаружено в 81,8 % (95 % ДИ 48,2–97,7 %) (10 из 11) случаев, причем мутации, ответственные за ЛУ ко всем трем препаратам (рифампицину, изониазиду и фторхинолонам), были найдены в 63,6 % (95 % ДИ 30,8–89,1 %) (7 из 11) случаев, мутации, обуславливающие ЛУ к рифампицину и изониазиду, были выявлены в 18,2 % (95 % ДИ 2,3–51,8 %) (2 из 11) случаев.
Таким образом, МБТ, содержащиеся в респираторном материале, полученном на хирургическом этапе лечения, и операционном материале, по спектру ЛЧ не отличались.
Для подтверждения идентичности генотипов МБТ, выделенных из респираторного материала с генотипами МБТ, полученных из очага туберкулезного поражения, было проведено VNTR-генотипирование МБТ из респираторного и операционного материала. По результатам исследования все изученные изоляты M. tuberculosis отнесены к группе Beijing (100 %) и разделены на 5 кластеров, которые имели следующие VNTR-профили по MIRU10, MIRU26, MIRU31, Mtub21, ETRA, QUB26, QUB11b: 3755476 (2 пациента), 3755486 (2), 3455466 (1), 3755466 (1), 3555486 (1).
При сравнении генотипов МБТ из операционного материала с генотипами МБТ из респираторного материала различий обнаружено не было. У всех пациентов был выявлен один генотип микобактерий. Таким образом, генотипы МБТ, выделенных при исследовании резектатов легких, по 7 локусам были идентичны генотипам МБТ, полученных при исследовании респираторного материала.
Заключение
Проведенное исследование показало, что МБТ, полученные из респираторного материала на этапе хирургического лечения и из операционного материала больных туберкулезом легких, по изученным клинически значимым биологическим свойствам (скорость роста, ЛЧ, генотип) одинаковы.
При этом резецированные участки легких являются более информативным материалом, позволяющим получить достоверные сведения о возбудителе туберкулеза непосредственно из очага туберкулезного поражения по сравнению с респираторным материалом на момент хирургического вмешательства, так как выявляемость МБТ из респираторного материала и, соответственно, определение их ЛЧ существенно ниже, чем из резектатов.
Таким образом, для адекватного и своевременного назначения режимов химиотерапии в послеоперационном периоде лечения больных с туберкулезом легких целесообразно исследовать ЛЧ МБТ, выделенных из резецированных участков легких.
Рецензенты:
Мордовской Г.Г., д.м.н., заведующий отделом лабораторной диагностики Свердловского областного противотуберкулезного диспансера, г. Екатеринбург;
Чугаев Ю.П., д.м.н., профессор кафедры фтизиатрии и пульмонологии Уральского государственного медицинского университета, г. Екатеринбург.
Работа поступила в редакцию 15.09.2014.