Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ЛЕГКИХ И РЕСПИРАТОРНОГО МАТЕРИАЛА

Белоусова К.В. 1 Кравченко М.А. 1 Бердников Р.Б. 1 Вахрушева Д.В. 1 Скорняков С.Н. 1 Еремеева Н.И. 1
1 Уральский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Министерства здравоохранения России
Цель данного исследования – провести сравнительный анализ клинически значимых биологических свойств (массивность и скорость роста, лекарственная чувствительность, генотипические особенности) Mycobacterium tuberculosis, выделенных из резецированных участков легких и респираторного материала. Проведено культуральное (посев на плотную питательную среду с последующим определением лекарственной чувствительности методом абсолютных концентраций) и молекулярно-генетическое (ПЦР в режиме реального времени, Биочип, MIRU-VNTR-генотипирование) исследование мокроты, промывных вод бронхов и операционного материала от 291 больного туберкулезом легких. Микобактерии туберкулеза, полученные из респираторного материала на этапе хирургического лечения и из операционного материала больных туберкулезом легких, по изученным клинически значимым биологическим свойствам не отличались. При этом резецированные участки легких являются наиболее информативным материалом, позволяющим получить достоверные сведения о возбудителе туберкулеза непосредственно из очага туберкулезного поражения.
микобактерии туберкулеза
лекарственная устойчивость
операционный материал легкого
бактериологическая диагностика
биочип-диагностика
генотипирование
1. База данных «MIRU-VNTRplus» (http://www.miru-vntrplus.org).
2. Барило В.Н. Ускоренное определение чувствительности M. tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам в системе «BACTEC MGIT 960» и на биочипах «ТБ-Биочип» / В.Н. Барило, А.В. Кузьмин, Л.Н. Черноусова, В.И. Голышевская // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2009. – № 11. – С. 56–60.
3. Бобровская К.В. Лекарственная чувствительность микобактерий туберкулеза, полученных из мокроты и операционного материала больных с туберкулемами легких / К.В. Бобровская, М.А. Кравченко, Р.Б. Бердников // Уральский Медицинский журнал. – 2013. – № 2 (107). – С. 50–53.
4. Гаева Н.Д. Опыт применения тест-систем «ТБ-Биочип (МЛУ)» в Липецкой области / Н.Д. Гаева, О.В. Жилин, С.Р. Ивлева, О.А. Овчинникова // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2010. – № 12. – С. 57–59.
5. Концепции химиотерапии и этиологической (микробиологической и молекулярно-биологической) диагностики туберкулеза в Российской Федерации на современном этапе: проект методических рекомендаций // Медицинский альянс. – 2013. – № 1. – С. 15.
6. Подгаева В.А., Канавина Н.В. Эпидемическая ситуация по туберкулезу и деятельности противотуберкулезной службы на Урале в 2013 году: стат. материалы / ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России [под ред. С.Н. Скорнякова]. – Екатеринбург, 2014.
7. Репин Ю.М. Значение лекарственной устойчивости микобактерий в хирургии туберкулеза легких / Ю.М. Репин, А.О. Авестян, А.В. Елькин, Т.Ф. Оттен, Т.Б. Ряснянская, М.А. Трофимов // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2001. – № 9. – С. 6–9.
8. Скорняков С.Н. Медико-социальная оценка и пути повышения результативности комплексного лечения ограниченных форм туберкулеза легких / С.Н. Скорняков, С.С. Карсканова, А.С. Мальцева, И.Я. Мотус, М.А. Кравченко // Фтизиатрия и пульмонология. – 2011. – № 1. – С. 5–10.
9. Global tuberculosis report 2013 // WHO Library Cataloguing-in-Publication Data. – 2013. – Р. 45–58.

Проблема лекарственной устойчивости (ЛУ) микобактерий туберкулеза (МБТ) к противотуберкулезным препаратам (ПТП) приобрела в последнее время глобальное значение [6, 9]. Клиническое излечение у впервые выявленных больных с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) МБТ остается низким и составляет 34,6 %, что в три раза ниже уровня клинического излечения туберкулеза у больных с лекарственно чувствительным возбудителем туберкулеза [6].

Необходимость персонализированного подхода к выбору тактики лечения больного, основанного на получении своевременной и достоверной информации о клинически значимых биологических свойствах выделенного от него возбудителя туберкулеза, не вызывает сомнений. Однако вследствие снижения интенсивности бактериовыделения и жизнеспособности МБТ на этапах терапевтического лечения пациента или его исходной олигобактериальности традиционные методы выделения возбудителя из мокроты больного в значительной части случаев недостаточно информативны [3, 7]. Классические бактериологические методы обнаружения, идентификации и определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) МБТ длительны и весьма ресурсоемки. В связи с этим в последние годы приоритет отдается применению современных молекулярно-генетических методов, направленных на решение этих задач [2, 4].

Свойства возбудителя непосредственно в очагах туберкулезного поражения остаются малоизученными. Бактериологическое исследование резецированного участка легкого определяется необходимостью проведения послеоперационного курса химиотерапии у больного с учетом данных о возбудителе и его ЛЧ к ПТП [5, 8]. Очевидно, что комплексное лабораторное исследование резецированного участка, пораженного туберкулезом легкого, дает более полные сведения об особенностях патологического процесса, возбудителе заболевания, его видовой принадлежности и чувствительности к ПТП.

Цель исследования: провести сравнительный анализ клинически значимых биологических свойств (массивность и скорость роста, лекарственная чувствительность, генотипические особенности) Mycobacterium tuberculosis, выделенных из резецированных участков легких и респираторного материала.

Материалы и методы исследования

Культуральными и молекулярно-генетическими методами исследовали двукратно мокроту и/или промывные воды бронхов (n = 219) (при возможности получения материала) непосредственно перед операцией и резецированные участки легких (n = 291) больных, перенесших хирургический этап лечения туберкулеза легких в УНИИ фтизиопульмонологии.

Всего было исследовано 510 образцов биологического материала и 102 культуры МБТ, полученных от 291 больного различными клиническими формами туберкулеза легких. У 259 (89,0 % (95 % ДИ 84,8–92,4 %)) больных туберкулезом легких был установлен диагноз «туберкулема легкого», у остальных 32 (11,0 % (95 % ДИ 7,7–15,2 %)) – «кавернозный» и «фиброзно-кавернозный туберкулез легких».

Культуральное исследование включало посев деконтаминированных осадков мокроты, промывных вод бронхов и гомогенизированных кусочков операционного материала на плотную питательную среду Левенштейна – Йенсена («Himedia Laboratories», Индия) с последующим определением ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций. Культуры M. tuberculosis по чувствительности к основным ПТП делили на ЛЧ и ЛУ в соответствии с приказом МЗ РФ № 109 от 21.03.2003 г. (концентрация изониазида – 1 мкг/мл, рифампицина – 40 мкг/мл, этамбутола – 2 мкг/мл, стрептомицина – 10 мкг/мл, канамицина – 30 мкг/мл).

Скорость роста рассматривали как интервал времени от посева до появления роста в пробирках. Появление колоний МБТ в срок до 30 дней считали быстрым ростом, от 30 до 50 дней – замедленным, свыше 50 дней – медленным ростом. Массивность роста – число колоний, выросших в пробирке. Скудным рост считали при массивности до 20 колоний (1+), умеренным – 21–100 колоний (2+), обильным – свыше 100 колоний (3+).

Обработку первичного материала для выделения ДНК проводили коммерческим набором «ДНК-сорб-В» («Амплисенс», Россия). Операционный материал предварительно гомогенизировали. Для амплификации специфической нуклеотидной последовательности IS6110 геномного материала методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в «режиме реального времени» использовали тест-систему «АмплиСенс®MTC-FL» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) и амплификатор iCycler iQ5 (Bio-Rad, США).

Для молекулярно-генетического исследования мутаций ЛУ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам был использован метод гибридизации с флуоресцентным изображением на биологическом микрочипе «ТБ-БИОЧИП®» и «ТБ-БИОЧИП®-2» (ООО «Биочип-ИМБ», Москва). Анализ результатов гибридизации проводили на приборе «Чипдетектор-01» с использованием специализированного программного обеспечения «Imageware» (ООО «Биочип-ИМБ», Москва).

Методом MIRU-VNTR типирования было исследовано 18 культур МБТ, полученных от 7 больных (7 изолятов, выделенных из операционного материала, и 11 изолятов, выделенных из респираторного материала этих же больных). Изоляты были генотипированы с использованием 7 локусов: MIRU10, MIRU26, MIRU31, Mtub21, ETRA, QUB26, QUB11b. Для постановки ПЦР использовали реактивы производства «Интерлабсервис» (Москва) и праймеры для ПЦР ООО «Синтол» (Москва). Принадлежность к генетической линии определяли путем сравнения полученных MIRU-VNTR профилей изолятов с имеющимися в базе данных «MIRU-VNTRplus» [1].

Результаты проведенных исследований статистически обработаны с использованием лицензионной компьютерной программы MedCalc® V12.6.1 (MedCalc Software, Бельгия). Для всех статистических критериев ошибка первого рода устанавливалась равной 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При сравнительном анализе биологических свойств МБТ, полученных из различного материала, было установлено, что скорость роста МБТ (n = 37), выделенных из респираторного материала, составила 59 (15) суток; скорость роста МБТ (n = 65), выделенных из операционного материала, составила 56 (17) суток. Максимальный срок появления роста культур – 88 суток, минимальный – 21 сутки. В скорости роста культур МБТ, выделенных из респираторного и операционного материала, статистических различий не найдено (р = 0,261).

Вместе с тем массивность роста культур МБТ, полученных из респираторного и операционного материала, статистически различалась (р = 0,01). При посеве резецированных участков легких в 40,0 % (95 % ДИ 28,0–52,9 %) (26 из 65) случаев отмечали умеренный рост, в 36,9 % (95 % ДИ 25,3–49,8 %) (24 из 65) – обильный, в 23,1 % (95 % ДИ 13,5–35,2 %) (15 из 65) – скудный. При посеве респираторного материала скудный рост отмечали в 69,4 % (95 % ДИ 51,8–83,6 %) (26 из 37) случаев, обильный – 19,5 % (95 % ДИ 8,2–36,1 %) (7 из 37), умеренный – 11,1 % (95 % ДИ 3,1–26,0 %) (4 из 37). Это, по-видимому, можно объяснить тем, что в операционном материале содержится большее количество МБТ, чем в респираторном материале.

Лекарственная чувствительность МБТ была определена методом абсолютных концентраций в 18,8 % (95 % ДИ 13,6–25,0 %) (37 из 197) образцов респираторного материала и в 22,3 % (95 % ДИ 17,6–27,5 %) (65 из 291) образцов операционного материала. С помощью метода биочипов было определено наличие или отсутствие мутаций, обуславливающих лекарственную устойчивость к ПТП, в геноме МБТ в 7,5 % (95 % ДИ 3,9–12,7 %) (12 из 161) образцов респираторного материала и в 95,9 % (95 % ДИ 92,3–97,9 %) (279 из 291) образцов операционного материала.

Сравнительный анализ ЛЧ МБТ, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения методом абсолютных концентраций, удалось провести у 19 больных.

При сопоставлении результатов определения ЛЧ МБТ из резецированных участков легких (n = 19), с результатами ЛЧ МБТ из респираторного материала (n = 23), полученных от одних и тех же пациентов (n = 19) на хирургическом этапе лечения, методом абсолютных концентраций совпадение составило 100,0 %.

У всех 19 больных были выявлены культуры МБТ с ЛУ. У 8 (42,1 % (95 % ДИ 20,2–66,5 %)) пациентов были найдены МБТ с ЛУ к пяти ПТП (изониазиду, рифампицину, этамбутолу, стрептомицину и канамицину). У 6 (31,5 % (95 % ДИ 12,5–56,5 %)) больных были выявлены МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину, этамбутолу и стрептомицину. 2 (10,5 % (95 % ДИ 1,3–33,1 %)) пациента имели МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину, этамбутолу и канамицину. Культуры МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину, этамбутолу и канамицину, а также культуры МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину и стрептомицину были получены от 1 (5,3 % (95 % ДИ 0,13–26,1 %)) больного каждая. Таким образом, у 18 (94,7 % (95 % ДИ 73,9–99,9 %)) больных были обнаружены ЛУ МБТ к 2 основным ПТП I ряда (изониазиду и рифампицину), то есть имели МЛУ МБТ. Еще от 1 (5,3 % (95 % ДИ 0,13–26,1 %)) больного была получена культура МБТ с ЛУ к изониазиду, этамбутолу, стрептомицину и канамицину.

Сравнительный анализ результатов определения наличия или отсутствия мутаций, обуславливающих ЛУ, в геноме МБТ, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения, методом биочипов удалось провести только у 11 больных.

При сравнении результатов определения наличия или отсутствия мутаций в геноме МБТ, выделенных из респираторного материала (n = 12), с результатами определения наличия или отсутствия мутаций в геноме МБТ, полученных из резецированных участков легких (n = 11) одних и тех же пациентов (n = 11), методом биочипов совпадение составило 100,0 %.

У 1 (9,1 % (95 % ДИ 0,2–41,3 %)) из 12 больных и в респираторном, и в операционном материале была обнаружена ДНК МБТ, не содержащая мутаций в генах rpoB, katG, inhA, промоторной области ahp-oxyR и gyrA, в материале 10 (90,9 % (95 % ДИ 58,7–99,8 %)) больных выявлялись мутации в указанных генах МБТ. В 9,1 % (95 % ДИ 0,2–41,3 %) (1 из 11) случаев были обнаружены моноустойчивые МБТ, которые имели мутации в гене inhA, отвечающие за ЛУ к изониазиду. Сочетание мутаций в генах, ответственных за МЛУ МБТ, было обнаружено в 81,8 % (95 % ДИ 48,2–97,7 %) (10 из 11) случаев, причем мутации, ответственные за ЛУ ко всем трем препаратам (рифампицину, изониазиду и фторхинолонам), были найдены в 63,6 % (95 % ДИ 30,8–89,1 %) (7 из 11) случаев, мутации, обуславливающие ЛУ к рифампицину и изониазиду, были выявлены в 18,2 % (95 % ДИ 2,3–51,8 %) (2 из 11) случаев.

Таким образом, МБТ, содержащиеся в респираторном материале, полученном на хирургическом этапе лечения, и операционном материале, по спектру ЛЧ не отличались.

Для подтверждения идентичности генотипов МБТ, выделенных из респираторного материала с генотипами МБТ, полученных из очага туберкулезного поражения, было проведено VNTR-генотипирование МБТ из респираторного и операционного материала. По результатам исследования все изученные изоляты M. tuberculosis отнесены к группе Beijing (100 %) и разделены на 5 кластеров, которые имели следующие VNTR-профили по MIRU10, MIRU26, MIRU31, Mtub21, ETRA, QUB26, QUB11b: 3755476 (2 пациента), 3755486 (2), 3455466 (1), 3755466 (1), 3555486 (1).

При сравнении генотипов МБТ из операционного материала с генотипами МБТ из респираторного материала различий обнаружено не было. У всех пациентов был выявлен один генотип микобактерий. Таким образом, генотипы МБТ, выделенных при исследовании резектатов легких, по 7 локусам были идентичны генотипам МБТ, полученных при исследовании респираторного материала.

Заключение

Проведенное исследование показало, что МБТ, полученные из респираторного материала на этапе хирургического лечения и из операционного материала больных туберкулезом легких, по изученным клинически значимым биологическим свойствам (скорость роста, ЛЧ, генотип) одинаковы.

При этом резецированные участки легких являются более информативным материалом, позволяющим получить достоверные сведения о возбудителе туберкулеза непосредственно из очага туберкулезного поражения по сравнению с респираторным материалом на момент хирургического вмешательства, так как выявляемость МБТ из респираторного материала и, соответственно, определение их ЛЧ существенно ниже, чем из резектатов.

Таким образом, для адекватного и своевременного назначения режимов химиотерапии в послеоперационном периоде лечения больных с туберкулезом легких целесообразно исследовать ЛЧ МБТ, выделенных из резецированных участков легких.

Рецензенты:

Мордовской Г.Г., д.м.н., заведующий отделом лабораторной диагностики Свердловского областного противотуберкулезного диспансера, г. Екатеринбург;

Чугаев Ю.П., д.м.н., профессор кафедры фтизиатрии и пульмонологии Уральского государственного медицинского университета, г. Екатеринбург.

Работа поступила в редакцию 15.09.2014.


Библиографическая ссылка

Белоусова К.В., Кравченко М.А., Бердников Р.Б., Вахрушева Д.В., Скорняков С.Н., Еремеева Н.И. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ЛЕГКИХ И РЕСПИРАТОРНОГО МАТЕРИАЛА // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 9-11. – С. 2452-2455;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35378 (дата обращения: 23.06.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074