Рак молочной железы (РМЖ) является распространенной патологией среди женщин во всем мире, поэтому предпринимаются попытки поиска новых методов адъювантной терапии, направленных на элиминацию метастазов из региональных лимфатических узлов, в том числе и с использованием веществ, активирующих клетки иммунной системы [4–6]. Известно, что препараты нуклеиновых кислот, применяемые в терапии пациентов с онкологической патологией, способствуют активации противоопухолевой защиты организма опухоленосителя. В то же время нет сведений об их влиянии на клетки опухоли при сочетанной терапии цитостатическими препаратами и экзогенной ДНК.
Поэтому целью исследования стало изучение эффекта фрагментированной ДНК на эффективность цитостатических препаратов in vitro на клетки экспериментального рака молочной железы у крыс линии Wistar.
Материалы и методы исследование
Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и с соблюдением принципов Хельсинкской декларации BMA (2000). Эксперимент выполнен на 25 крысах-самках линии Wistar с массой 300–350 г. Животные содержались на стандартной лабораторной диете и имели свободный доступ к воде. РМЖ у 4 крыс-самок линии Wistar индуцировали введением N-метил-N-нитрозомочевины (Sigma-Aldrich, США) 5 раз с интервалом в 7 дней подкожно в область одной и той же молочной железы (2-я молочная железа справа) [7]. Животных из эксперимента выводили через 6 месяцев под наркозом (40 мг/кг нембутана внутрибрюшинно; Sigma-Aldrich, США). Измельченные ножницами кусочки молочной железы инкубировали при 37 °С с 0,05 % раствором коллагеназы I типа в течение 4 часов. Далее вносили 50 мкл FCS (фетальная телячья сыворотка; HyClone, США), клетки осаждали при 1500 об/мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость удаляли и дважды отмывали полученную суспензию клеток молочной железы в 5 мл забуференного физиологического раствора при 1500 об/мин в течение 5 минут. Осадок клеток молочной железы ресуспендировали в питательной среде RPMI 1640 (Биолот, СПб) и пропускали через фильтр (размер пор 80 мкм) для удаления клеточного дебриса, подсчитывали количество жизнеспособных клеток. Клеточный цикл в клетках РМЖ исследовали по стандартной методике с использованием пропидия йодида (Becton Dickinson, США) на проточном цитометре FACSCantoII (Becton Dickinson, США). Морфологическую картину клеток РМЖ, как нативных, так и подвергшихся воздействию лекарственных веществ, оценивали под инвертированным микроскопом Olympus (Япония). Пролиферативный потенциал клеток РМЖ оценивали спектрофотометрически (длина волны 492 нм) по включению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида – МТТ (Sigma-Aldrich, США). Интенсивность пролиферативного потенциала изучали через 72 часа в присутствии 5-фторурацила (240 мкг/мл; Ebewe, Австрия), метотрексата (40 мкг/мл; Ebewe, Австрия), циклофосфана (48 мкг/мл; ОАО «Биохимия», Саранск) в отсутствии и присутствии 80 мкг/мл фрагментированной ДНК плаценты человека, а также натрия дезоксирибонуклеата – Деринат (ЗАО «Техномедсервис», Москва) в дозировке 120 мкг/мл. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квартилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна – Уитни и принималась при значениях p < 0,05 [3].
Результаты исследования и их обсуждение
Как видно из табл. 1, анализ пролиферативного потенциала клеток РМЖ выявил статистически значимое возрастание спонтанной пролиферации клеток в присутствии фрагментированной ДНК и Дерината. Установлено, что наличие в питательной среде фрагментированной ДНК также способствует статистически значимой активации пролиферации клеток РМЖ в присутствие 5-фторурацила. Более того, инкубация клеток РМЖ с препаратом сравнения для эффекта фрагментированной ДНК – Деринатом, также выявила статистически значимое увеличение пролиферативного потенциала клеток РМЖ в присутствии фрагментированной ДНК. В отношении антипролиферативного действия метотрексата показано статистически значимое возрастание пролиферации клеток рака молочной железы в присутствие как фрагментированной ДНК, так и Дерината. Эффект циклофосфана на пролиферацию клеток РМЖ выражался в статистически значимом снижении ее, как для клеток РМЖ, инкубировавшихся в питательной среде без источников экзогенной ДНК, так и для клеток, инкубировавшихся в питательной среде с экзогенной ДНК. Воздействие комбинации всех цитостатиков на пролиферацию клеток РМЖ привело к статистически значимому возрастанию пролиферативного потенциала при инкубации их с фрагментированной ДНК. При исследовании ингибирования пролиферации клеток РМЖ под воздействием ПХТ были получены следующие результаты (табл. 1). Так, выраженность ингибирующего влияния 5 фторурацила статистически значимо ниже при инкубации клеток РМЖ с фрагментированной ДНК.
Ингибирующий эффект метотрексата был статистически значимо выше только в отсутствие фрагментированной ДНК. Эффект циклофосфана также статистически значимо ниже при инкубации клеток РМЖ с фрагментированной ДНК. Отмечено более выраженное подавление пролиферативного потенциала клеток рака молочной железы in vitro при наличии в среде всех цитостатиков и Дерината по сравнению с аналогичным эффектом фрагментированной ДНК.
Таким образом, наличие экзогенной ДНК в культуре клеток рака молочной железы активирует пролиферативный потенциал и тем самым снижает антипролиферативное действие цитостатических препаратов in vitro.
В основе данного эффекта экзогенной ДНК лежит способность вступать в конкурентную борьбу экзогенного урацила за связывание с 5-фторурацилом, а также отвлекать на себя эффект других цитостатических препаратов и тем самым отменять антипролиферативный эффект лекарственных препаратов.
Более того, полученные данные подтверждаются и результатами исследования клеточного цикла под воздействием цитостатических препаратов (табл. 2).
Так, свежевыделенные клетки РМЖ распределялись по клеточному циклу следующим образом: суб-G0G1 (< 2N) = 35,8 %; G0G1 (2N) = 62,6 %; S (2N) = 0,4 %; G2 + M (4N) = 0,1 %. Клетки РМЖ, инкубировавшиеся с экзогенной ДНК, в большем проценте случаев находились в апоптозе, в них также интенсивнее наблюдались синтетические процессы и выше митотическая активность. В то же время под воздействием цитостатических препаратов процессы апоптоза в клетках РМЖ, инкубировавшихся с экзогенной ДНК, были менее выраженными, чем в контроле.
Полученные выше результаты исследования эффекта полихимиотерапии клеток РМЖ в тест-системе in vitro также подтверждаются данными микроскопического исследования. Как видно из рисунка, в присутствии экзогенной ДНК отмечается более выраженное увеличение количества клеток в спонтанном тесте. Кроме этого, наличие экзогенной ДНК в питательной среде способствовало выживанию клеток РМЖ при инкубации их с цитостатическими препаратами.
Таблица 1
Эффект цитостатических препаратов in vitro на пролиферативный потенциал клеток рака молочной железы от крыс линии Wistar, индуцированного введением N-метил-N-нитрозомочевины (Me; Lq-Hq)
|
Параметры |
Уровень пролиферации (в у. ед. опт. пл.) |
|||||
|
исходный |
5-ФУ |
Метотрексат |
Циклофосфан |
ПХТ |
||
|
1 |
Без экзогенной ДНК |
0,12; 0,12–0,13 p1-2 = 0,00031 p1-3 = 0,035 |
0,11; 0,10–0,11 p1-2 = 0,00003 |
0,10; 0,10–0,11 p1-2 = 0,00004 p1-3 = 0,049 |
0,10; 0,10–0,11 p1-2 = 0,00003 p1-3 = 0,039 |
0,10; 0,09–0,10 p1-2 = 0,00003 |
|
Процент ингибиции |
0,0 |
12,17; 9,62–16,48 p1-2 = 0,00003 |
14,26; 9,29–20,35 p1-2 = 0,024 |
14,93; 12,0–17,08 p1-2 = 0,00003 |
19,94; 12,79–34,33 |
|
|
2 |
С добавлением фрДНК |
0,14; 0,14–0,16 |
0,14; 0,14–0,16 p2-3 = 0,0023 |
0,14; 0,13–0,15 |
0,15; 0,14–0,16 p2-3 = 0,0011 |
0,15; 0,14–0,16 p2-3 = 0,00075 |
|
Процент ингибиции |
0,0 |
3,64; –8,73–5,37 p2-3 = 0,00075 |
7,23; 5,96–11,26 |
3,27; –10,21–6,89 p2-3 = 0,00075 |
14,78; 11,19–24,68 |
|
|
3 |
С добавлением Дерината |
0,14; 0,13–0,15 |
0,11; 0,11–0,13 |
0,12; 0,11–0,14 |
0,12; 0,11–0,12 |
0,09; 0,09-0,09 |
|
% ингибиции |
0,0 |
13,03; 10,26–24,24 |
6,87; 5,44–8,59 |
15,24; 13,64-20,0 |
32,98; 25,64–43,87 p2-3 = 0,024 |
|
Примечание. 5ФУ – 5-фторурацил; ПХТ – полихимиотерапия; фрДНК – пролиферация при наличии фрагментированной ДНК.
Таблица 2
Показатели нахождения клеток РМЖ в фазах клеточного цикла (в %)
|
Параметры |
Клетки РМЖ (1) |
Клетки РМЖ + фрагментированная ДНК (2) |
Клетки РМЖ + Деринат (3) |
|||||||||
|
суб-G0 G1 |
G0G1 |
S |
G2 + M |
суб-G0G1 |
G0G1 |
S |
G2 + M |
суб-G0G1 |
G0G1 |
S |
G2 + M |
|
|
инт |
31,2 |
67,6 |
0,3 |
0,0 |
38,3 |
60,8 |
0,6 |
0,1 |
36,0 |
63,2 |
1,0 |
0,1 |
|
5ФУ |
32,5 |
65,8 |
0,6 |
0,0 |
31,5 |
67,3 |
0,7 |
0,0 |
29,7 |
69,5 |
0,9 |
0,0 |
|
Мет |
37,5 |
62,2 |
0,5 |
0,0 |
31,3 |
67,5 |
0,7 |
0,1 |
27,5 |
71,8 |
0,7 |
0,1 |
|
ЦФ |
32,6 |
67,0 |
0,5 |
0,0 |
29,5 |
69,8 |
0,7 |
0,0 |
27,8 |
71,5 |
0,9 |
0,0 |
|
ПХТ |
31,6 |
68,0 |
0,4 |
0,1 |
31,0 |
68,4 |
0,9 |
0,1 |
25,0 |
73,5 |
0,7 |
0,1 |
Примечание. инт – интактные; РМЖ – рак молочной железы; 5ФУ – 5-фторурацил; Мет – метотрексат; ЦФ – циклофосфан; ПХТ – полихимиотерапия.
Контроль
Спонтанная 
5ФУ 
Мет
ЦФ
ПХТ
Фрагментированная ДНК
Спонтанная
5ФУ 
Мет 
ЦФ 
ПХТ
Деринат
Спонтанная 
5ФУ 
Мет 
ЦФ 
ПХТ
Микрофотографии клеток рака молочной железы в присутствии экзогенной ДНЕ и цитостатиков (х400). 5ФУ – 5-фторурацил; Мет – метотрексат; ЦФ – циклофосфан; ПХТ – полихимиотерапия
Нами показано, что наличие в питательной среде фрагментированной ДНК для свежевыделенных клеток РМЖ in vitro приводило к повышению пролиферативной активности клеток опухоли, снижению чувствительности к действию цитостатиков, как при их отдельной инкубации, так и при комбинации всех 3 лекарственных препаратов с клетками опухоли по сравнению с контролем и в большинстве случаев с препаратом сравнения по экзогенной ДНК (Панаген). Что не противоречит имеющимся литературным данным о включении во внутренние компартменты опухолевых клеток фрагментов ДНК [1–2]. Известно, что максимальным цитостатическим эффектом циклофосфана являются его метаболиты, получаемые в организме после обработки микросомальными ферментами гепатоцитов. Однако известно, что и сам циклофосфан без in vitro способен оказывать антипролиферативное действие на пролиферацию, как спонтанную, так и митоген-индуцированную лимфоцитов человека [8]. Поэтому выявленные нами антипролиферативные эффекты циклофосфана имеют под собой литературное обоснование, хотя и противоречат сложившемуся в среде ученых и врачей мнению об отсутствии у нативного циклофосфана антипролиферативного эффекта. Более того, мы полагаем, что наличие экзогенной ДНК в данной модели указывает на возможность отмены ингибирующего эффекта цитостатиков на клетки опухоли за счет конкурентного взаимодействия во внешней среде препаратов с фрагментами ДНК и тем самым резкого снижения цитостатического действия препаратов. Иными словами, наличие фрагментированной ДНК является источником урацила для опухолевых клеток, с одной стороны, а с другой стороны, процессы метилирования, вероятнее всего, быстрее происходят во фрагментированной ДНК, нежели в клетках опухоли.
Заключение
Таким образом, исходя из вышеизложенного, становится очевидным тот факт, что наличие в питательной среде экзогенной ДНК приводит к уменьшению выраженности цитостатического влияния препаратов, применяющихся для полихимиотерапии при РМЖ, с одной стороны. С другой стороны, экзогенная ДНК способствует активации пролиферации клеток РМЖ.
Выражаем благодарность за техническую и организационную помощь в проведении экспериментов Алямкиной Е.А., Долговой Е.В., Рогачеву В.А. и Богачеву С.С., сотрудникам ИЦИГа.
Рецензенты:
Бгатова Н.П., д.б.н., зав. лабораторией ультраструктурных исследований, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск;
Горчаков В.Н., д.м.н., зав. лабораторией функциональной морфологии лимфатической системы, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 04.06.2014.