Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Лыков А.П. 1 Бондаренко Н.А. 1 Повещенко О.В. 1 Кабаков А.В. 1 Райтер Т.В. 1 Казаков О.В. 1 Стрункин Д.Н. 2 Повещенко А.Ф. 1 Коненков В.И. 1

---

1 ФГБУ «НИИ КЭЛ» СО РАМН

2 ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН

Поиск новых лекарственных средств, способных активировать иммунную защиту при онкологической патологии, в том числе и при раке молочной железы, остается актуальной проблемой. Определенные надежды возлагаются на препараты на основе нуклеиновых кислот. Однако мало исследованы эффекты комбинации фрагментированной ДНК с цитостатическими препаратами. Проведено исследование эффекта экзогенной ДНК при совместной инкубации с цитостатическими препаратами на клетки экспериментального рака молочной железы у крыс Wistar. Показано, что присутствие экзогенной ДНК в культуральной среде стимулирует пролиферацию клеток рака молочной железы в присутствии 5-фторурацила, метотрексата, циклофосфана и при комбинации цитостатиков. Отмена антипролиферативного эффекта наличием экзогенной ДНК в культуральной среде также подтверждается данными изучения фаз клеточного цикла и визуальным исследованием.

Статья в формате PDF

646 KB

экзогенная ДНК

рак молочной железы

полихимиотерапия

пролиферация

1. Алямкина Е.А. Действие экзогенной ДНК, ассоциированной с протамином, на рост экспериментальных опухолей мыши / Е.А. Алямкина, А.С. Лихачева, В.П. Николин // Вопросы онкологии. – 2009. – № 6. – С. 765–768.

2. Долгова Е.В. Интернализация экзогенной ДНК во внутренние компартменты клеток костного мозга мышей / Е.В. Долгова, В.П. Николин, Н.А Попова // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2012. – № 2. – С. 397–414.

3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. – М.: Практика, 1999. – 459 с.

4. Кулигина Е.Ш. Эпидемиологические и молекулярные аспекты рака молочной железы // Практическая онкология. – 2010. – № 4. – С. 203–216.

5. Стенина М.Б. Перспективные направления развития лекарственной терапии рака молочной железы // Практическая онкология. – 2002. – № 4. – С. 262–272.

6. Стенина М.Б. Рак молочной железы: наиболее важные научные события и выводы последних лет / М.Б. Стенина, М.А. Фролова // Практическая онкология. – 2011. – № 1. – С. 6–11.

7. Чочиева А.Р. Химиопрофилактика рака молочной железы в эксперименте: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. – 2010. – 47 с.

8. Sharma B.S. Effects of cyclophosphamide on in vitro human lymphocyte culture and mitogenic stimulation // Transplantation. – 1983. – Vol. 35. – Р. 165–168.

Рак молочной железы (РМЖ) является распространенной патологией среди женщин во всем мире, поэтому предпринимаются попытки поиска новых методов адъювантной терапии, направленных на элиминацию метастазов из региональных лимфатических узлов, в том числе и с использованием веществ, активирующих клетки иммунной системы [4–6]. Известно, что препараты нуклеиновых кислот, применяемые в терапии пациентов с онкологической патологией, способствуют активации противоопухолевой защиты организма опухоленосителя. В то же время нет сведений об их влиянии на клетки опухоли при сочетанной терапии цитостатическими препаратами и экзогенной ДНК.

Поэтому целью исследования стало изучение эффекта фрагментированной ДНК на эффективность цитостатических препаратов in vitro на клетки экспериментального рака молочной железы у крыс линии Wistar.

Материалы и методы исследование

Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и с соблюдением принципов Хельсинкской декларации BMA (2000). Эксперимент выполнен на 25 крысах-самках линии Wistar с массой 300–350 г. Животные содержались на стандартной лабораторной диете и имели свободный доступ к воде. РМЖ у 4 крыс-самок линии Wistar индуцировали введением N-метил-N-нитрозомочевины (Sigma-Aldrich, США) 5 раз с интервалом в 7 дней подкожно в область одной и той же молочной железы (2-я молочная железа справа) [7]. Животных из эксперимента выводили через 6 месяцев под наркозом (40 мг/кг нембутана внутрибрюшинно; Sigma-Aldrich, США). Измельченные ножницами кусочки молочной железы инкубировали при 37 °С с 0,05 % раствором коллагеназы I типа в течение 4 часов. Далее вносили 50 мкл FCS (фетальная телячья сыворотка; HyClone, США), клетки осаждали при 1500 об/мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость удаляли и дважды отмывали полученную суспензию клеток молочной железы в 5 мл забуференного физиологического раствора при 1500 об/мин в течение 5 минут. Осадок клеток молочной железы ресуспендировали в питательной среде RPMI 1640 (Биолот, СПб) и пропускали через фильтр (размер пор 80 мкм) для удаления клеточного дебриса, подсчитывали количество жизнеспособных клеток. Клеточный цикл в клетках РМЖ исследовали по стандартной методике с использованием пропидия йодида (Becton Dickinson, США) на проточном цитометре FACSCantoII (Becton Dickinson, США). Морфологическую картину клеток РМЖ, как нативных, так и подвергшихся воздействию лекарственных веществ, оценивали под инвертированным микроскопом Olympus (Япония). Пролиферативный потенциал клеток РМЖ оценивали спектрофотометрически (длина волны 492 нм) по включению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида – МТТ (Sigma-Aldrich, США). Интенсивность пролиферативного потенциала изучали через 72 часа в присутствии 5-фторурацила (240 мкг/мл; Ebewe, Австрия), метотрексата (40 мкг/мл; Ebewe, Австрия), циклофосфана (48 мкг/мл; ОАО «Биохимия», Саранск) в отсутствии и присутствии 80 мкг/мл фрагментированной ДНК плаценты человека, а также натрия дезоксирибонуклеата – Деринат (ЗАО «Техномедсервис», Москва) в дозировке 120 мкг/мл. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квартилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна – Уитни и принималась при значениях p < 0,05 [3].

Результаты исследования и их обсуждение

Как видно из табл. 1, анализ пролиферативного потенциала клеток РМЖ выявил статистически значимое возрастание спонтанной пролиферации клеток в присутствии фрагментированной ДНК и Дерината. Установлено, что наличие в питательной среде фрагментированной ДНК также способствует статистически значимой активации пролиферации клеток РМЖ в присутствие 5-фторурацила. Более того, инкубация клеток РМЖ с препаратом сравнения для эффекта фрагментированной ДНК – Деринатом, также выявила статистически значимое увеличение пролиферативного потенциала клеток РМЖ в присутствии фрагментированной ДНК. В отношении антипролиферативного действия метотрексата показано статистически значимое возрастание пролиферации клеток рака молочной железы в присутствие как фрагментированной ДНК, так и Дерината. Эффект циклофосфана на пролиферацию клеток РМЖ выражался в статистически значимом снижении ее, как для клеток РМЖ, инкубировавшихся в питательной среде без источников экзогенной ДНК, так и для клеток, инкубировавшихся в питательной среде с экзогенной ДНК. Воздействие комбинации всех цитостатиков на пролиферацию клеток РМЖ привело к статистически значимому возрастанию пролиферативного потенциала при инкубации их с фрагментированной ДНК. При исследовании ингибирования пролиферации клеток РМЖ под воздействием ПХТ были получены следующие результаты (табл. 1). Так, выраженность ингибирующего влияния 5 фторурацила статистически значимо ниже при инкубации клеток РМЖ с фрагментированной ДНК.

Ингибирующий эффект метотрексата был статистически значимо выше только в отсутствие фрагментированной ДНК. Эффект циклофосфана также статистически значимо ниже при инкубации клеток РМЖ с фрагментированной ДНК. Отмечено более выраженное подавление пролиферативного потенциала клеток рака молочной железы in vitro при наличии в среде всех цитостатиков и Дерината по сравнению с аналогичным эффектом фрагментированной ДНК.

Таким образом, наличие экзогенной ДНК в культуре клеток рака молочной железы активирует пролиферативный потенциал и тем самым снижает антипролиферативное действие цитостатических препаратов in vitro.

В основе данного эффекта экзогенной ДНК лежит способность вступать в конкурентную борьбу экзогенного урацила за связывание с 5-фторурацилом, а также отвлекать на себя эффект других цитостатических препаратов и тем самым отменять антипролиферативный эффект лекарственных препаратов.

Более того, полученные данные подтверждаются и результатами исследования клеточного цикла под воздействием цитостатических препаратов (табл. 2).

Так, свежевыделенные клетки РМЖ распределялись по клеточному циклу следующим образом: суб-G₀G₁ (< 2N) = 35,8 %; G₀G₁ (2N) = 62,6 %; S (2N) = 0,4 %; G₂ + M (4N) = 0,1 %. Клетки РМЖ, инкубировавшиеся с экзогенной ДНК, в большем проценте случаев находились в апоптозе, в них также интенсивнее наблюдались синтетические процессы и выше митотическая активность. В то же время под воздействием цитостатических препаратов процессы апоптоза в клетках РМЖ, инкубировавшихся с экзогенной ДНК, были менее выраженными, чем в контроле.

Полученные выше результаты исследования эффекта полихимиотерапии клеток РМЖ в тест-системе in vitro также подтверждаются данными микроскопического исследования. Как видно из рисунка, в присутствии экзогенной ДНК отмечается более выраженное увеличение количества клеток в спонтанном тесте. Кроме этого, наличие экзогенной ДНК в питательной среде способствовало выживанию клеток РМЖ при инкубации их с цитостатическими препаратами.

Таблица 1

Эффект цитостатических препаратов in vitro на пролиферативный потенциал клеток рака молочной железы от крыс линии Wistar, индуцированного введением N-метил-N-нитрозомочевины (Me; Lq-Hq)

Примечание. 5ФУ – 5-фторурацил; ПХТ – полихимиотерапия; фрДНК – пролиферация при наличии фрагментированной ДНК.

Таблица 2

Показатели нахождения клеток РМЖ в фазах клеточного цикла (в %)

Примечание. инт – интактные; РМЖ – рак молочной железы; 5ФУ – 5-фторурацил; Мет – метотрексат; ЦФ – циклофосфан; ПХТ – полихимиотерапия.

Контроль

Спонтанная 5ФУ Мет ЦФ ПХТ

Фрагментированная ДНК

 Спонтанная5ФУ Мет  ЦФ ПХТ

Деринат

Спонтанная 5ФУ Мет  ЦФ  ПХТ

Микрофотографии клеток рака молочной железы в присутствии экзогенной ДНЕ и цитостатиков (х400). 5ФУ – 5-фторурацил; Мет – метотрексат; ЦФ – циклофосфан; ПХТ – полихимиотерапия

Нами показано, что наличие в питательной среде фрагментированной ДНК для свежевыделенных клеток РМЖ in vitro приводило к повышению пролиферативной активности клеток опухоли, снижению чувствительности к действию цитостатиков, как при их отдельной инкубации, так и при комбинации всех 3 лекарственных препаратов с клетками опухоли по сравнению с контролем и в большинстве случаев с препаратом сравнения по экзогенной ДНК (Панаген). Что не противоречит имеющимся литературным данным о включении во внутренние компартменты опухолевых клеток фрагментов ДНК [1–2]. Известно, что максимальным цитостатическим эффектом циклофосфана являются его метаболиты, получаемые в организме после обработки микросомальными ферментами гепатоцитов. Однако известно, что и сам циклофосфан без in vitro способен оказывать антипролиферативное действие на пролиферацию, как спонтанную, так и митоген-индуцированную лимфоцитов человека [8]. Поэтому выявленные нами антипролиферативные эффекты циклофосфана имеют под собой литературное обоснование, хотя и противоречат сложившемуся в среде ученых и врачей мнению об отсутствии у нативного циклофосфана антипролиферативного эффекта. Более того, мы полагаем, что наличие экзогенной ДНК в данной модели указывает на возможность отмены ингибирующего эффекта цитостатиков на клетки опухоли за счет конкурентного взаимодействия во внешней среде препаратов с фрагментами ДНК и тем самым резкого снижения цитостатического действия препаратов. Иными словами, наличие фрагментированной ДНК является источником урацила для опухолевых клеток, с одной стороны, а с другой стороны, процессы метилирования, вероятнее всего, быстрее происходят во фрагментированной ДНК, нежели в клетках опухоли.

Заключение

Таким образом, исходя из вышеизложенного, становится очевидным тот факт, что наличие в питательной среде экзогенной ДНК приводит к уменьшению выраженности цитостатического влияния препаратов, применяющихся для полихимиотерапии при РМЖ, с одной стороны. С другой стороны, экзогенная ДНК способствует активации пролиферации клеток РМЖ.

Выражаем благодарность за техническую и организационную помощь в проведении экспериментов Алямкиной Е.А., Долговой Е.В., Рогачеву В.А. и Богачеву С.С., сотрудникам ИЦИГа.

Рецензенты:

Бгатова Н.П., д.б.н., зав. лабораторией ультраструктурных исследований, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск;

Горчаков В.Н., д.м.н., зав. лабораторией функциональной морфологии лимфатической системы, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 04.06.2014.

Библиографическая ссылка