Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

CERULOPLASMIN: INTRAMOLECULAR ELECTRON TRANSFER AND FERROXIDASE ACTIVITY

¹Moshkov K.A. 1 ²Zaitsev V.N. 1 ¹Romanovskaya E.V. 1 ¹Stefanov V.E. 1
1 Centre for Biomolecular Sciences
Authors review the results of their research and data available from literature on the mechanism of ferroxidase activity of copper-containing human plasma enzyme ceruloplasmin (Fe(II): oxygen-oxidoreductase; EC 1.16.3.1). The described mechanism is based on the analysis of structural data and suggests that ceruloplasmin catalyzes consecutive transfer of 4 electrons from substrate to О2 molecule which, by virtue of four-electron reduction of О-О bond, is then converted into Н2О molecule according to the scheme: 4Fe2++O2+4H+=2H2O+4Fe3+. The process of intramolecular electron transfer proceeds from oxidized Fe2+ions along the chain of copper binding sites from mononuclear center T1Cu to trinuclear cluster, consisting of T2Cu center and dinuclear center T3Cu (site of О2 reduction to Н2О). Ions Fe2+ are localized in labile binding centers (M2+centers of binding bivalent metal ions), located in proximity of T1Cu centers. Formed in the oxidation reaction, Fe3+ ions are further transported to M3+ centers of binding trivalent metal ions located in close proximity to the protein surface. As a result of subsequent transport from ceruloplasmin globule, Fe3+ becomes capable of forming complexes with apo-transferrin.
copper proteins
ceruloplasmin
ferroxidase
structure
electron transfer
1.Bento I., Peixoto C., Zaitsev V.N., Lindley P.F. Ceruloplasmin revisited: structural and functional roles of various metal cation-binding sites. // Acta Cryst., 2007, D63, pp. 240–248.
2.Bielli P., Calabrese L. Structure to function relationship in ceruloplasmin: a «moonlighting» protein. // Cell. Mol. Life Sci., 2002, v. 59, pp. 1413–1427.
3.Ehrenwald E., Fox P.L. Isolation of nonlabile human ceruloplasmin by chromatographic removal of plasma metallopeptidase. // Arch. Biochem. Biophys., 1994, v. 309, no. 2, pp. 392–395.
4.Holmberg C.G. On the presence of a laccase-like enzyme in serum and its relation to the copper in serum. // Acta Physiol. Scand., 1944, v. 8, no. 2–3, pp. 227–229.
5.Holmberg C.G., Laurell C.-B. Investigations in serum copper. II. Isolation of the copper containing protein, and a description of some of its properties. // Acta Chem. Scand., 1948, v. 2, no.7, pp. 550–556.
6.Holmberg C.G., Laurell C.-B. Investigations in serum copper. III. Coeruloplasmin as an enzyme. // Acta. Chem. Scand., 1951, v. 5, no. 3, pp. 476–480.
7.Komori H., Higuchi Y. Structure and molecular evolution of multicopper blue proteins. // BioMol Concepts, 2010, v. 1, pp. 31–40.
8.Laurie S.H., Mohammed E.S. Caeruloplasmin: the enigmatic copper protein. // Coord. Chem. Rev., 1980, v. 33, no. 3, pp. 279м312.
9.Lindley P.F., Card G., Zaitseva I., Zaitsev V., Reinhammar B., Selin-Lindgren E., Yoshida K. An X-ray structural study of human ceruloplasmin in relation to ferroxidase activity. //J. Biol. Inorg. Chem., 1997, v. 2, pp. 454–463.
10.Lindley P., Card G., Zaitseva I., Zaitsev V.N. Ceruloplasmin: the beginning of the end of an enigma. // Persp. Bioinorg. Chem., 1999, v. 4, pp. 51–89.
11.Machonkin T.E., Solomon E.T. The thermodynamic, kinetics, and molecular transfer in human ceruloplasmin. // J. Amer. Chem. Soc., 2000, v.122, pp. 12547–12560.
12.Osaki S., Johnson D.A., Frieden E. The possible significance of the ferrous oxidase activity of ceruloplasmin in normal human serum. // J. Biol. Chem., 1966, v. 241, no. 12, pp. 2746–2751.
13.Stoj C.S., Kosman D.J. Copper proteins: oxidases. // Encyclopedia of Inorg. Chem., 2006, pp. 1–26.
14.Protein Data Bank, Available at: http:/www.resb.org/pdb/results/results.do?qrid=AD946E1b&tabtoshow=Current.
15.Superfamily 1.75. HMM library and genome assignments server (2013), Available at: http://www.supfam.cs.bris.ac.uk/SUPERFAMYLY/index.html.
16.Vashchenko G., MacGillivray R.T.A. Multi-copper oxidases and human iron metabolism. // Nutrients, 2013, v. 5, pp. 2289–2313.
17. Vasin A., Klotchenko S., Puchkova L. Phylogenetic analysis of six-domain multi-copper blue proteins. // PLOS Current Tree of Life., 2013, pp. 1–17.
18.White K.N., Conesa C., Sanches L., Amini M., Farnaud S., Lorvoralak C., Evans R.W. The transfer of iron between ceruloplasmin and transferrins. // Biochim. Biophys. Acta, 2012, v. 1820, pp. 411–416.
19.Zaitsev V.V., Zaitseva I., Papiz M., Lindley P.F. An X-ray crystallographic study of the binding sites of the azide inhibitor and organic substrates to ceruloplasmin, a multi-copper oxidase in the plasma. // J. Biol. Inorg. Chem., 1999, v. 4, no. 5, pp. 579–587.
20.Zaitseva I., Zaitsev V.N., Card G., Moshkov K., Bax B., Ralph A., Lindley P. The X-ray structure of human ceruloplasmin at 3.1 Å: nature of the copper centres. // J. Biol. Inorg. Chem., 1996, v. 1, pp. 15–23.

В 1944 г. шведский исследователь Холмберг обнаружил в плазме крови человека фермент, сходный по свойствам с растительным медьпротеидом – лакказой [4]. Дальнейшее интенсивное изучение этого фермента показало, что он связывает почти 95 % всей меди плазмы крови и характеризуется широким спектром оксидазной активности [5, 6]. Из-за синего цвета его концентрированных растворов этому ферменту было дано название «церулоплазмин» (blue substance from plasma). Он окисляет аскорбат, гидрохинон, ароматические диамины и дифенолы, биогенные амины – адреналин, норадреналин, серотонин, дофамин, ионы Cu+ и Fe²+. В итоге в Классификации ферментов ему было присвоено систематическое наименование Fe(II):кислород оксидоредуктаза (КФ 1.16.3.1).

Также была обнаружена его способность дисмутировать супероксидные радикалы, связанная с глутатионом пероксидазная активность, активность как NO2‒-синтазы и NO-оксидазы. Фермент может выступать в качестве прооксиданта, участвуя в окислении липопротеидов низкой плотности (см, например, обзоры [2, 16]).

Такая мультифункциональная природа церулоплазмина, с одной стороны, и отсутствие данных о его истинной физиологической роли (ролях), с другой, позволило назвать его «загадочным синим белком» [8]. Начало конца этой загадки (the beginning of the end of an enigma [10]) было положено
исследованиями атомной структуры церулоплазмина методом рентгеноструктурного анализа [1, 9, 10, 14, 19, 20]. Было установлено, что молекула церулоплазмина (единичная полипептидная цепь, 1046 аминокислотных остатков) состоит из шести субглобул (доменов). По структурному сходству эти домены разделяются на две группы: нечетные домены 1, 3 и 5 и четные домены 2, 4 и 6. Топология укладки полипептидной цепи в этих доменах соответствует таковой в однодоменных «синих» медьпротеидах, относящихся к суперсемейству купредоксинов. Сам же церулоплазмин относится к семейству мультидоменных купредоксинов, в состав которого также входят такие белки, как лакказа, оксидазы CotA и CueO, аскорбатоксидаза, факторы свертывания крови V и VIII, гефестин, циклопен, билирубиноксидаза, белок Fet3p, нитритредуктаза, металлооксидазы и др. [15]. Представители этого семейства чрезвычайно широко распространены в природе: они обнаружены в археях, бактериях и эукариотах [7, 17].

Медь-связывающие центры белков купредоксинового семейства принято классифицировать по трем типам [13]. В центрах Т1Cu (т.наз. «синих») в качестве лигандов иона Cu выявлены два остатка His, один – Cys и один – Met («каноническая четверка» остатков). Остаток Met в ряде медьпротеидов замещен на Leu, Phe или Glu. В центрах Т2Cu (т.наз. «не синих») ион Cu координирован двумя остатками His и гидроксильной группой или молекулой Н2О. Центры Т3Cu (т.наз. биядерные) содержат два антиферромагнитно спаренных иона Cu2+, каждый из которых связан с тремя остатками His, а между этими ионами находится либо ОН-группа, либо молекула O2. Причины этого будут объяснены ниже. Центры Т1Cu и Т3Cu сближены друг с другом, образуя т.наз. триядерный кластер.

В церулоплазмине центры T1Cu находятся только в четных доменах, а триядерный кластер – между доменами 1 и 6. Центры Т1Cu в доменах 4 и 6 сформированы «канонической четверкой» лигандов – His637, H685, Cys680 и Met690 (домен 4) и His975, His1026, Cys1021 и Met1031 (домен 6), в то время как в домене 2 остаток Met замещен на очень слабо связанный с ионом Cu остаток Leu (His276, His324, Cys319 и Leu329) [20]. Скорее всего, ион Cu в центре Т1Cu домена 2 постоянно находится в восстановленном состоянии – Cu+ [11]. Требуются дополнительные исследования для выяснения вопроса о функциональной роли этого центра. Не исключено, что он функционально неактивен и является своеобразным «эволюционным реликтом». Расстояния между тремя центрами Т1Сu очень близки друг к другу и находятся в диапазоне 17,5–17,9 Å. Центр Т1Cu в домене 6 находится на расстоянии 12,5–13 Å от ионов Cu2+ биядерного центра, а все три иона Cu2+ в триядерном кластере сближены на расстояние 3,4-4,5 Å. Указанное выше расстояние между центрами Т1Cu в доменах 4 и 6 достаточно для эффективного переноса электронов, что обеспечивает одномоментное окисление более чем одной молекулы субстрата (рис. 1) [9, 11].

Строение триядерного кластера (Cu2 + Cu3 + Cu4) показано на рис. 2. Данные рентгеноструктурного анализа показали, что центр Т2Cu (Cu4) находится в двух конфигурациях, отражающих различные стадии каталитического акта [1]. В одной конфигурации с ионом Cu этого центра связана ОН-группа, в другой – молекула H2O (W148). В любой из этих конфигураций ион Cu координирован остатками His101 и His978.

В домене 6 предположительно существует дополнительный центр связывания двухвалентных ионов металлов (Со, Fe, Cu) – т.наз. «labile» центр [1, 9] (M2+-центр по терминологии [11]). В случае Cu2+ лигандами такого иона могут служить остатки от домена 2: Glu272 и от домена 6: His940, Glu935 и Asp1025. Последний остаток характеризуется двумя альтернативными конфигурациями. В одной из них этот остаток ориентирован по направлению к М2+-центру, в другой – от этого центра, так что атом О (дельта 1) образует междоменную водородную связь с атомом N (дельта 2) остатка Asn271 домена 2. Степень заполнения этого центра – 50 %. Также возможно участие по крайней мере трех молекул Н2О (W111, W200 и W292) в связывании катиона этого центра. Учитывая, что в центрах T1Cu находятся три иона Cu и еще три – в триядерном центре, общее число связанных с церулоплазмином ионов Cu превышает шесть, что согласуется с данными, полученными ранее другими методами [3].

В домене 2 указанный для домена 6 мотив связывания двухвалентного катиона отсутствует; положение, эквивалентное остатку His940, занимает Tyr241.

В домене 2 указанный для домена 6 мотив связывания двухвалентного катиона отсутствует; положение, эквивалентное остатку His940, занимает Tyr241.

Что же касается домена 4, то в нем более вероятно существование дополнительного центра связывания молекулы H2O (W201). Она образует водородные связи с His602 (2,28 Å), Glu971 (2,35 Å) и со второй молекулой Н2О (W321). Расстояние между W201 и W321 – 2,44 Å. В свою очередь, молекула W321 образует водородную связь с Glu597 [1].

pic_47.tif

Рис. 1. Центры связывания ионов металлов в домене 6 церулоплазмина [9]. Лиганды центра
T1Cu (нижняя часть рисунка): Нis975, H1026, Cys1021 и Met1031; лиганды «labile» M2+-центра (средняя часть рисунка): His940, Glu935, Asp1025 и Glu272; лиганды «holding» М3+-центра (верхняя часть рисунка): Glu931, Glu932, Glu935 и Asp230

pic_48.tif

Рис. 2. Триядерный кластер в церулоплазмине между доменами 1 и 6 [1]. Лиганды иона
Cu2 в биядерном центре T2Cu: His163, His 980, His1020; лиганды иона Cu3 в биядерном центре T3Cu: His103, H161 и His1022; лиганды иона Cu4 в центре T2Cu: His101 и His978. Показаны также связи молекул О2 и воды (W148) c ионами Cu. Степень заполнения этого центра для молекулы Н2О и гидроксильной группы – 50 %

Опыты с вымачиванием кристаллов церулоплазмина в растворах, содержащих соли Fe, показали, что ионы Fe2+ замещают ионы Cu2+ в М2+-центре домена 6 и после окисления до Fe3+ меняют свое местоположение, переходя в т.наз. «holding» центр (М3+-центры по терминологии [11]). Максимумы на карте электронной плотности, соответствующие этим центрам, имеют диффузную природу, что может быть объяснено тем, что существует популяция этих центров, немного отличающихся по своей структуре. В них могут занимать позиции не только один, но, видимо, и два катиона. В домене 6 возможными лигандами М3+-центра служат остатки Glu931, Glu932, Glu935 и Asp230. В процессах транслокации из М2+- в М3+-центр домена 6 ключевую роль играет их общий остаток Glu935 [9].

Можно предположить, что именно ионы Fe3+, перемещенные в М3+-центры, которые, как установлено, находятся вблизи поверхности белковой глобулы, далее включаются в апо-форму Fe-транспортного белка, трансферрина. Возможный путь такого перемещения ионов Fe3+ будет рассмотрен далее более подробно.

Наиболее вероятные пути внутримолекулярного транспорта электронов можно описать следующим образом [11]:

1. Транспорт электрона, высвободившегося в результате реакции Fe2+ → Fe3+, из М2+-центра в центр Т1Cu (домен 6) на расстояние 8,9 Å происходит, вероятнее всего, от Glu272 на His1026. Не исключены и два альтернативных пути на тот же лиганд центра Т1Cu, His1026, – либо от Asp1025, либо от His940. Кинетические данные свидетельствуют против возможности прямого переноса электрона от М2+-центра на триядерный кластер.

2. Транспорт электрона от центра Т1Cu (домен 6) на биядерный центр Т3Сu (расстояние 12,5 Å) может быть описан последовательностью: Cys1021 → Val1023 → His1022. Транспорт электрона на лиганд второго иона Cu2+ би­ядерного центра, His1020, имеет почти те же кинетические характеристики.

3. Транспорт электрона от центра Т1Cu в домене 4 на такой же центр в домене 6 (расстояние 17,8 Å) может осуществляться тремя кинетически почти эквивалентными путями. Из них несколько более предпочтительными являются следующие два:
His685 → Glu971 → Ile972 → His1026;
His685 → Glu971 → Asn970 → Asp973 → His975.

4. Транспорт электрона на центр Т2Cu. В этом случае существуют две возможности. Первая – от лиганда биядерного центра Т3Cu, His980, непосредственно на His978 (расстояние 4,2 Å). Здесь не исключен путь от второго иона Cu2+ биядерного центра через гидроксидную группировку на первый ион Cu2+ и далее как описано выше. Вторая возможность – транспорт электрона от центра Т1Cu: Cys1021 → His1020 → His978 (расстояние 14,4 Å). Эти данные свидетельствуют, что восстановление иона Cu2+ в центре Т2Cu непосредственно связано с восстановлением пары ионов Cu2+ в биядерном центре.

Суммируя вышеизложенное, можно обосновать 7-стадийную схему внутримолекулярного электронного транспорта в молекуле церулоплазмина. Первые три стадии представляют собой реакции восстановления центров Т1Cu в доменах 4 и 6, сопряженные с переходом ионов Fe2+ в окисленное состояние, и быстрый внутримолекулярный перенос электрона между восстановленными и окисленными формами центров Т1Cu в доменах 4 и 6. Стадия 4 соответствует восстановлению двухэлектронного акцептора – биядерного центра T3Cu в результате последовательного переноса двух электронов – одного от ранее восстановленного центра T1Cu и еще одного от иона Fe2+ (промежуточным продуктом этого процесса является полувосстановленный интермедиат биядерного центра). Альтернативой стадии 4 служит стадия 5, в которой два электрона от восстановленных центров T1Cu доменов 4 и 6 последовательно переносятся на биядерный центр, однако стадия 5 несколько менее вероятна, чем стадия 4. Восстановление центра T2Cu может происходить двояко: либо путем переноса электрона от восстановленного центра T1Cu домена 6 (стадия 6), либо путем переноса двух электронов от восстановленного биядерного центра на центр T2Cu и на ранее окисленный центр T1Cu домена 6 (стадии 6 и 7).

Все эти результаты позволяют конкретизировать выдвинутую еще в 1966 г. гипотезу [12] о том, что одна из основных физиологических функций церулоплазмина заключается в окислении ионов Fe2+ и их последующем встраивании в апо-форму трансферрина. К настоящему времени накоплен значительный массив экспериментальных (хотя и косвенных) данных, свидетельствующих в пользу того, что церулоплазмин может образовывать белок-белковые аддукты с трансферрином и лактоферрином [16]. Что же касается конкретного пути транспорта окисленных ионов Fe3+ наружу из глобулы церулоплазмина, то в недавней работе [18], использующей цитируемые выше данные расшифровки кристаллической структуры этого белка, была построена молекулярная модель комплекса церулоплазмина с N-долей лактроферрина. Согласно этой модели, ион Fe3+ достигает белковой поверхности по цепочке остатков: M3+-центр (остатки Glu932 и Glu935) → Glu753 → Asp921 → Asp297, после чего становится способным включаться в комплекс с лактоферрином.

Рецензенты:

Кокряков В.Н., д.б.н., профессор, отдел общей патологии и патологической физиологии, НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург;

Трусов А.А., д.ф.-м.н., профессор, зав. кафедрой молекулярной биофизики, физический факультет, Санкт-Петербургский государственный университет, г. Санкт-Петербург.

Работа поступила в редакцию 31.01.2014.