Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

¹Мошков К.А. 1 ²Зайцев В.Н. 1 ¹Романовская Е.В. 1 ¹Стефанов В.Е. 1

---

1 Centre for Biomolecular Sciences

В статье обобщены собственные иизвестные из литературы результаты исследований механизмов ферроксидазной активности медьсодержащего фермента плазмы крови человека – церулоплазмина (Fe(II):кислород оксидоредуктаза; КФ 1.16.3.1). Церулоплазмин катализирует последовательный перенос 4-х электронов от окисляемого субстрата на молекулу О2, которая врезультате четырехэлектронного восстановления О-О связи превращается вмолекулу Н2О по схеме: 4Fe²++О2+4H+=2H2O+4Fe³+. Процесс внутримолекулярного переноса электронов происходит от окисляемых ионов Fe2+по цепи медь-связывающих центров от одноядерного центра T1Cu ктриядерному кластеру, состоящему из центра T2Cu ибиядерного центра T3Cu (место восстановления О2 до Н2О). Ионы Fe²+ локализованы вт.наз. лабильных центрах связывания (М²+-центры связывания двухвалентных ионов металлов), расположенных вблизи центров T1Cu. Образовавшиеся вокислительной реакции ионы Fe³+ далее перемещаются вМ³+-центры связывания трехвалентных ионов металлов внепосредственной близости кбелковой поверхности. Врезультате дальнейшего транспорта ионов Fe³+ из глобулы церулоплазмина они могут вступать вкомплексы сапо-формой трансферрина.

Статья в формате PDF

472 KB

медьпротеиды

церулоплазмин

ферроксидаза

структура

транспорт электронов

1.Bento I., Peixoto C., Zaitsev V.N., Lindley P.F. Ceruloplasmin revisited: structural and functional roles of various metal cation-binding sites. // Acta Cryst., 2007, D63, pp. 240–248.

2.Bielli P., Calabrese L. Structure to function relationship in ceruloplasmin: a «moonlighting» protein. // Cell. Mol. Life Sci., 2002, v. 59, pp. 1413–1427.

3.Ehrenwald E., Fox P.L. Isolation of nonlabile human ceruloplasmin by chromatographic removal of plasma metallopeptidase. // Arch. Biochem. Biophys., 1994, v. 309, no. 2, pp. 392–395.

4.Holmberg C.G. On the presence of a laccase-like enzyme in serum and its relation to the copper in serum. // Acta Physiol. Scand., 1944, v. 8, no. 2–3, pp. 227–229.

5.Holmberg C.G., Laurell C.-B. Investigations in serum copper. II. Isolation of the copper containing protein, and a description of some of its properties. // Acta Chem. Scand., 1948, v. 2, no.7, pp. 550–556.

6.Holmberg C.G., Laurell C.-B. Investigations in serum copper. III. Coeruloplasmin as an enzyme. // Acta. Chem. Scand., 1951, v. 5, no. 3, pp. 476–480.

7.Komori H., Higuchi Y. Structure and molecular evolution of multicopper blue proteins. // BioMol Concepts, 2010, v. 1, pp. 31–40.

8.Laurie S.H., Mohammed E.S. Caeruloplasmin: the enigmatic copper protein. // Coord. Chem. Rev., 1980, v. 33, no. 3, pp. 279м312.

9.Lindley P.F., Card G., Zaitseva I., Zaitsev V., Reinhammar B., Selin-Lindgren E., Yoshida K. An X-ray structural study of human ceruloplasmin in relation to ferroxidase activity. //J. Biol. Inorg. Chem., 1997, v. 2, pp. 454–463.

10.Lindley P., Card G., Zaitseva I., Zaitsev V.N. Ceruloplasmin: the beginning of the end of an enigma. // Persp. Bioinorg. Chem., 1999, v. 4, pp. 51–89.

11.Machonkin T.E., Solomon E.T. The thermodynamic, kinetics, and molecular transfer in human ceruloplasmin. // J. Amer. Chem. Soc., 2000, v.122, pp. 12547–12560.

12.Osaki S., Johnson D.A., Frieden E. The possible significance of the ferrous oxidase activity of ceruloplasmin in normal human serum. // J. Biol. Chem., 1966, v. 241, no. 12, pp. 2746–2751.

13.Stoj C.S., Kosman D.J. Copper proteins: oxidases. // Encyclopedia of Inorg. Chem., 2006, pp. 1–26.

14.Protein Data Bank, Available at: http:/www.resb.org/pdb/results/results.do?qrid=AD946E1b&tabtoshow=Current.

15.Superfamily 1.75. HMM library and genome assignments server (2013), Available at: http://www.supfam.cs.bris.ac.uk/SUPERFAMYLY/index.html.

16.Vashchenko G., MacGillivray R.T.A. Multi-copper oxidases and human iron metabolism. // Nutrients, 2013, v. 5, pp. 2289–2313.

17. Vasin A., Klotchenko S., Puchkova L. Phylogenetic analysis of six-domain multi-copper blue proteins. // PLOS Current Tree of Life., 2013, pp. 1–17.

18.White K.N., Conesa C., Sanches L., Amini M., Farnaud S., Lorvoralak C., Evans R.W. The transfer of iron between ceruloplasmin and transferrins. // Biochim. Biophys. Acta, 2012, v. 1820, pp. 411–416.

19.Zaitsev V.V., Zaitseva I., Papiz M., Lindley P.F. An X-ray crystallographic study of the binding sites of the azide inhibitor and organic substrates to ceruloplasmin, a multi-copper oxidase in the plasma. // J. Biol. Inorg. Chem., 1999, v. 4, no. 5, pp. 579–587.

20.Zaitseva I., Zaitsev V.N., Card G., Moshkov K., Bax B., Ralph A., Lindley P. The X-ray structure of human ceruloplasmin at 3.1 Å: nature of the copper centres. // J. Biol. Inorg. Chem., 1996, v. 1, pp. 15–23.

В 1944 г. шведский исследователь Холмберг обнаружил в плазме крови человека фермент, сходный по свойствам с растительным медьпротеидом – лакказой [4]. Дальнейшее интенсивное изучение этого фермента показало, что он связывает почти 95 % всей меди плазмы крови и характеризуется широким спектром оксидазной активности [5, 6]. Из-за синего цвета его концентрированных растворов этому ферменту было дано название «церулоплазмин» (blue substance from plasma). Он окисляет аскорбат, гидрохинон, ароматические диамины и дифенолы, биогенные амины – адреналин, норадреналин, серотонин, дофамин, ионы Cu+ и Fe²+. В итоге в Классификации ферментов ему было присвоено систематическое наименование Fe(II):кислород оксидоредуктаза (КФ 1.16.3.1).

Также была обнаружена его способность дисмутировать супероксидные радикалы, связанная с глутатионом пероксидазная активность, активность как NO2‒-синтазы и NO-оксидазы. Фермент может выступать в качестве прооксиданта, участвуя в окислении липопротеидов низкой плотности (см, например, обзоры [2, 16]).

Такая мультифункциональная природа церулоплазмина, с одной стороны, и отсутствие данных о его истинной физиологической роли (ролях), с другой, позволило назвать его «загадочным синим белком» [8]. Начало конца этой загадки (the beginning of the end of an enigma [10]) было положено
исследованиями атомной структуры церулоплазмина методом рентгеноструктурного анализа [1, 9, 10, 14, 19, 20]. Было установлено, что молекула церулоплазмина (единичная полипептидная цепь, 1046 аминокислотных остатков) состоит из шести субглобул (доменов). По структурному сходству эти домены разделяются на две группы: нечетные домены 1, 3 и 5 и четные домены 2, 4 и 6. Топология укладки полипептидной цепи в этих доменах соответствует таковой в однодоменных «синих» медьпротеидах, относящихся к суперсемейству купредоксинов. Сам же церулоплазмин относится к семейству мультидоменных купредоксинов, в состав которого также входят такие белки, как лакказа, оксидазы CotA и CueO, аскорбатоксидаза, факторы свертывания крови V и VIII, гефестин, циклопен, билирубиноксидаза, белок Fet3p, нитритредуктаза, металлооксидазы и др. [15]. Представители этого семейства чрезвычайно широко распространены в природе: они обнаружены в археях, бактериях и эукариотах [7, 17].

Медь-связывающие центры белков купредоксинового семейства принято классифицировать по трем типам [13]. В центрах Т1Cu (т.наз. «синих») в качестве лигандов иона Cu выявлены два остатка His, один – Cys и один – Met («каноническая четверка» остатков). Остаток Met в ряде медьпротеидов замещен на Leu, Phe или Glu. В центрах Т2Cu (т.наз. «не синих») ион Cu координирован двумя остатками His и гидроксильной группой или молекулой Н2О. Центры Т3Cu (т.наз. биядерные) содержат два антиферромагнитно спаренных иона Cu2+, каждый из которых связан с тремя остатками His, а между этими ионами находится либо ОН-группа, либо молекула O2. Причины этого будут объяснены ниже. Центры Т1Cu и Т3Cu сближены друг с другом, образуя т.наз. триядерный кластер.

В церулоплазмине центры T1Cu находятся только в четных доменах, а триядерный кластер – между доменами 1 и 6. Центры Т1Cu в доменах 4 и 6 сформированы «канонической четверкой» лигандов – His637, H685, Cys680 и Met690 (домен 4) и His975, His1026, Cys1021 и Met1031 (домен 6), в то время как в домене 2 остаток Met замещен на очень слабо связанный с ионом Cu остаток Leu (His276, His324, Cys319 и Leu329) [20]. Скорее всего, ион Cu в центре Т1Cu домена 2 постоянно находится в восстановленном состоянии – Cu+ [11]. Требуются дополнительные исследования для выяснения вопроса о функциональной роли этого центра. Не исключено, что он функционально неактивен и является своеобразным «эволюционным реликтом». Расстояния между тремя центрами Т1Сu очень близки друг к другу и находятся в диапазоне 17,5–17,9 Å. Центр Т1Cu в домене 6 находится на расстоянии 12,5–13 Å от ионов Cu2+ биядерного центра, а все три иона Cu2+ в триядерном кластере сближены на расстояние 3,4-4,5 Å. Указанное выше расстояние между центрами Т1Cu в доменах 4 и 6 достаточно для эффективного переноса электронов, что обеспечивает одномоментное окисление более чем одной молекулы субстрата (рис. 1) [9, 11].

Строение триядерного кластера (Cu2 + Cu3 + Cu4) показано на рис. 2. Данные рентгеноструктурного анализа показали, что центр Т2Cu (Cu4) находится в двух конфигурациях, отражающих различные стадии каталитического акта [1]. В одной конфигурации с ионом Cu этого центра связана ОН-группа, в другой – молекула H2O (W148). В любой из этих конфигураций ион Cu координирован остатками His101 и His978.

В домене 6 предположительно существует дополнительный центр связывания двухвалентных ионов металлов (Со, Fe, Cu) – т.наз. «labile» центр [1, 9] (M2+-центр по терминологии [11]). В случае Cu2+ лигандами такого иона могут служить остатки от домена 2: Glu272 и от домена 6: His940, Glu935 и Asp1025. Последний остаток характеризуется двумя альтернативными конфигурациями. В одной из них этот остаток ориентирован по направлению к М2+-центру, в другой – от этого центра, так что атом О (дельта 1) образует междоменную водородную связь с атомом N (дельта 2) остатка Asn271 домена 2. Степень заполнения этого центра – 50 %. Также возможно участие по крайней мере трех молекул Н2О (W111, W200 и W292) в связывании катиона этого центра. Учитывая, что в центрах T1Cu находятся три иона Cu и еще три – в триядерном центре, общее число связанных с церулоплазмином ионов Cu превышает шесть, что согласуется с данными, полученными ранее другими методами [3].

В домене 2 указанный для домена 6 мотив связывания двухвалентного катиона отсутствует; положение, эквивалентное остатку His940, занимает Tyr241.

В домене 2 указанный для домена 6 мотив связывания двухвалентного катиона отсутствует; положение, эквивалентное остатку His940, занимает Tyr241.

Что же касается домена 4, то в нем более вероятно существование дополнительного центра связывания молекулы H2O (W201). Она образует водородные связи с His602 (2,28 Å), Glu971 (2,35 Å) и со второй молекулой Н2О (W321). Расстояние между W201 и W321 – 2,44 Å. В свою очередь, молекула W321 образует водородную связь с Glu597 [1].

Рис. 1. Центры связывания ионов металлов в домене 6 церулоплазмина [9]. Лиганды центра
T1Cu (нижняя часть рисунка): Нis975, H1026, Cys1021 и Met1031; лиганды «labile» M2+-центра (средняя часть рисунка): His940, Glu935, Asp1025 и Glu272; лиганды «holding» М3+-центра (верхняя часть рисунка): Glu931, Glu932, Glu935 и Asp230

Рис. 2. Триядерный кластер в церулоплазмине между доменами 1 и 6 [1]. Лиганды иона
Cu2 в биядерном центре T2Cu: His163, His 980, His1020; лиганды иона Cu3 в биядерном центре T3Cu: His103, H161 и His1022; лиганды иона Cu4 в центре T2Cu: His101 и His978. Показаны также связи молекул О2 и воды (W148) c ионами Cu. Степень заполнения этого центра для молекулы Н2О и гидроксильной группы – 50 %

Опыты с вымачиванием кристаллов церулоплазмина в растворах, содержащих соли Fe, показали, что ионы Fe2+ замещают ионы Cu2+ в М2+-центре домена 6 и после окисления до Fe3+ меняют свое местоположение, переходя в т.наз. «holding» центр (М3+-центры по терминологии [11]). Максимумы на карте электронной плотности, соответствующие этим центрам, имеют диффузную природу, что может быть объяснено тем, что существует популяция этих центров, немного отличающихся по своей структуре. В них могут занимать позиции не только один, но, видимо, и два катиона. В домене 6 возможными лигандами М3+-центра служат остатки Glu931, Glu932, Glu935 и Asp230. В процессах транслокации из М2+- в М3+-центр домена 6 ключевую роль играет их общий остаток Glu935 [9].

Можно предположить, что именно ионы Fe3+, перемещенные в М3+-центры, которые, как установлено, находятся вблизи поверхности белковой глобулы, далее включаются в апо-форму Fe-транспортного белка, трансферрина. Возможный путь такого перемещения ионов Fe3+ будет рассмотрен далее более подробно.

Наиболее вероятные пути внутримолекулярного транспорта электронов можно описать следующим образом [11]:

1. Транспорт электрона, высвободившегося в результате реакции Fe2+ → Fe3+, из М2+-центра в центр Т1Cu (домен 6) на расстояние 8,9 Å происходит, вероятнее всего, от Glu272 на His1026. Не исключены и два альтернативных пути на тот же лиганд центра Т1Cu, His1026, – либо от Asp1025, либо от His940. Кинетические данные свидетельствуют против возможности прямого переноса электрона от М2+-центра на триядерный кластер.

2. Транспорт электрона от центра Т1Cu (домен 6) на биядерный центр Т3Сu (расстояние 12,5 Å) может быть описан последовательностью: Cys1021 → Val1023 → His1022. Транспорт электрона на лиганд второго иона Cu2+ би­ядерного центра, His1020, имеет почти те же кинетические характеристики.

3. Транспорт электрона от центра Т1Cu в домене 4 на такой же центр в домене 6 (расстояние 17,8 Å) может осуществляться тремя кинетически почти эквивалентными путями. Из них несколько более предпочтительными являются следующие два:
His685 → Glu971 → Ile972 → His1026;
His685 → Glu971 → Asn970 → Asp973 → His975.

4. Транспорт электрона на центр Т2Cu. В этом случае существуют две возможности. Первая – от лиганда биядерного центра Т3Cu, His980, непосредственно на His978 (расстояние 4,2 Å). Здесь не исключен путь от второго иона Cu2+ биядерного центра через гидроксидную группировку на первый ион Cu2+ и далее как описано выше. Вторая возможность – транспорт электрона от центра Т1Cu: Cys1021 → His1020 → His978 (расстояние 14,4 Å). Эти данные свидетельствуют, что восстановление иона Cu2+ в центре Т2Cu непосредственно связано с восстановлением пары ионов Cu2+ в биядерном центре.

Суммируя вышеизложенное, можно обосновать 7-стадийную схему внутримолекулярного электронного транспорта в молекуле церулоплазмина. Первые три стадии представляют собой реакции восстановления центров Т1Cu в доменах 4 и 6, сопряженные с переходом ионов Fe2+ в окисленное состояние, и быстрый внутримолекулярный перенос электрона между восстановленными и окисленными формами центров Т1Cu в доменах 4 и 6. Стадия 4 соответствует восстановлению двухэлектронного акцептора – биядерного центра T3Cu в результате последовательного переноса двух электронов – одного от ранее восстановленного центра T1Cu и еще одного от иона Fe2+ (промежуточным продуктом этого процесса является полувосстановленный интермедиат биядерного центра). Альтернативой стадии 4 служит стадия 5, в которой два электрона от восстановленных центров T1Cu доменов 4 и 6 последовательно переносятся на биядерный центр, однако стадия 5 несколько менее вероятна, чем стадия 4. Восстановление центра T2Cu может происходить двояко: либо путем переноса электрона от восстановленного центра T1Cu домена 6 (стадия 6), либо путем переноса двух электронов от восстановленного биядерного центра на центр T2Cu и на ранее окисленный центр T1Cu домена 6 (стадии 6 и 7).

Все эти результаты позволяют конкретизировать выдвинутую еще в 1966 г. гипотезу [12] о том, что одна из основных физиологических функций церулоплазмина заключается в окислении ионов Fe2+ и их последующем встраивании в апо-форму трансферрина. К настоящему времени накоплен значительный массив экспериментальных (хотя и косвенных) данных, свидетельствующих в пользу того, что церулоплазмин может образовывать белок-белковые аддукты с трансферрином и лактоферрином [16]. Что же касается конкретного пути транспорта окисленных ионов Fe3+ наружу из глобулы церулоплазмина, то в недавней работе [18], использующей цитируемые выше данные расшифровки кристаллической структуры этого белка, была построена молекулярная модель комплекса церулоплазмина с N-долей лактроферрина. Согласно этой модели, ион Fe3+ достигает белковой поверхности по цепочке остатков: M3+-центр (остатки Glu932 и Glu935) → Glu753 → Asp921 → Asp297, после чего становится способным включаться в комплекс с лактоферрином.

Рецензенты:

Кокряков В.Н., д.б.н., профессор, отдел общей патологии и патологической физиологии, НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург;

Трусов А.А., д.ф.-м.н., профессор, зав. кафедрой молекулярной биофизики, физический факультет, Санкт-Петербургский государственный университет, г. Санкт-Петербург.

Работа поступила в редакцию 31.01.2014.

Библиографическая ссылка