Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В настоящее время применение стимуляторов роста на птицеводческих предприятиях приобрело массовый характер и является важнейшим фактором снижения себестоимости продукции и обеспечения ее конкурентоспособности в условиях быстрого роста производства. В то же время получение очищенных субстанций ростовых факторов, пригодных для парентерального применения, остается дорогостоящим в применении и требует длительных сроков на разработку. В результате птицеводческим хозяйствам приходится прибегать к массовому применению потенциально опасных для потребителя химических средств стимулирования роста: синтетическим стероидным гормонам [3]. Экономически эффективной и безо­пасной для человека альтернативой этому укоренившемуся на практике подходу является разработка живых вакцин и продуцентов ростовых факторов на базе полностью безопасных микроорганизмов, обладающих естественной антагонистической активностью к энтеропатогенам, в частности, мезофильных видов бацилл [5]. Этот подход не является полностью новым: в течение многих лет он оправдывает себя в ходе применения пробиотических штаммов, большинство из которых являются природными продуцентами бактерицидных пептидов.

Эти штаммы представляют собой экономически эффективный и полностью безопасный заменитель антибиотиков. Применение таких штаммов в качестве добавки в корм вызывает пролонгированный эффект подавления патогенной микрофлоры, в то же время, улучшая метаболический потенциал среды кишечника за счет синтеза витаминов, полисахаридов и других биологически активных веществ. В совокупности применение пробиотиков в птицеводстве существенно снижает смертность поголовья, приводя к повышению суточных привесов [5]. Введение в геном эффективных пробиотических штаммов бацилл генов ростовых факторов, в частности, гена соматолиберина, может существенно дополнить и расширить лечебно-профилактический эффект от их применения, практически не увеличивая затраты на получение препаратов по сравнению с традиционными штаммами.

Существенным фактором, осложняющим практическое использование потенциала пробиотических препаратов на основе бацилл, является несовершенство экспрессионных систем введения чужеродных генов в эти микроорганизмы. Существующие плазмидные векторы для бацилл не обладают достаточной репликативной и физиологической стабильностью. Кроме того, введение в организм сельскохозяйственных животных внехромосомных генетических элементов нежелательно с точки зрения биобезопасности [6].

Целью настоящей работы явилось создание новых векторных систем для экспрессии полусинтетических генов соматолиберина курицы, способных стабильно функционировать в составе бациллярных штаммов при получении бактерийного препарата пробиотического назначения в промышленных условиях и пригодного для применения на отечественных птицеводческих предприятиях.

Материалы и методы исследования

Для конструирования рекомбинантных пробиотических штаммов бацилл был разработан и синтезирован вариант гена соматолиберина курицы, оптимизированный для экспрессии в бактериях. Для этого с помощью ПЦР из генома курицы были клонированы два экзона гена соматолиберина [4], которые затем были сшиты и введены в состав вектора pQE30 (Qiagen, США). Геномная ДНК курицы была выделена из мышечной ткани методом фенольной экстракции [2, 7]. Полученная базовая конструкция pQE-SLN была использована для амплификации искусственных генов, кодирующих производные предшественника соматолиберина (пептиды GHRH и PACAP) с последующим введением ПЦР-продуктов желаемой последовательности в состав вектора pQE30 и получением конструкций pQE-GHRH и pQE-PACAP. Полученные конструкции использовали для получения интегративных векторов для экспрессии в клетках B. subtilis. Для этого в конструкцию pQE-SLN вводили промотор гена WprA B. subtilis и мини-ген Е-пептида устойчивости к эритромицину. Правильность трансгенной вставки контролировали посредством прямого секвенирования.

На основании известной интрон-экзонной организации гена соматолиберина курицы были сконструированы две пары праймеров SLN1-SLN2 и SLN3-SLN4 (рис. 1). Праймеры позволяли получить ген соматолиберина, кодирующий полноразмерный зрелый гормон без пропептида и секреторного лидера, аминокислотная последовательность которого соответствует сплайсоформе I первичного транскрипта. На 5'-конец праймера SLN3 была введена последовательность из 20 нуклеотидов, комплементарная праймеру SLN2, что позволяло продуктам ПЦР, полученным с использованием праймеров SLN2 и SLN3, взаимно отжигаться друг с другом. С помощью пары праймеров SLN1-SLN2 на матрице геномной ДНК курицы был получен продукт размером 104 п.н., включающий последовательность II экзона гена соматолиберина, а с помощью пары праймеров SLN3-SLN4 - продукт размером 241 п.н., соответствующий III экзону того же гена.

Первичные продукты ПЦР были очищены элюцией из агарозного геля, объединены и использованы в качестве матрицы для проведения ПЦР с праймерами SLN1-SLN4. В результате был получен продукт размером 325 п.н. После элюции из агарозного геля он был обработан рестриктазами BamHI и SalI и клонирован в вектор pQE30, предварительно расщепленный по сайтам BamHI и SalI. В итоге была отобрана конструкция pQE-SLN, содержащая ген соматолиберина желаемой последовательности.

Полученная конструкция pQE-SLN дала высокую продукцию рекомбинантного белка, который был очищен до гомогенного состояния. Поскольку максимальная эффективность действия соматолиберина достигается только в присутствии агониста - аденилатциклаза-активи­рую­щего пептида (PACAP), а в геноме млекопитающих ген PACAP существует независимо от гена соматолиберина (GHRH), разработанную конструкцию pQE-SLN использовали в качестве исходной для получения искусственных генов, кодирующих производные предшественника соматолиберина - пептиды GHRH (рис. 2а) и PACAP (рис. 2б).

На матрице pQE-SLN был проведен ПЦР с праймерами SLN1-SLN102 (размер продукта 156 п. н.) и праймерами SLN101-SLN4 (размер продукта 181 п. н.). После элюции из агарозного геля эти продукты были обработаны рестриктазами BamHI и SalI и клонированы в вектор pQE30, предварительно расщепленный по сайтам BamHI и SalI. В итоге были отобраны конструкции pQE-GHRH и pQE-PACAP, содержащие последовательности генов пептидов GHRH и PACAP, соответственно.

Полученные базовые конструкции pQE-SLN, pQE-GHRH и pQE-PACAP были использованы для получения интегративных векторов для экспрессии в клетках B. subtilis. Для этого в конструкции вводили промотор гена WprA B. subtilis, служивший одновременно плечом для гомологичной рекомбинации при интеграции в геном бактерии, и мини-ген Е-пептида, придающий бациллам устойчивость к эритромицину.

ДНК-дуплекс искусственного мини-гена Е-пептида был получен с использованием праймеров Em1 и Em2 (рис. 3а) в эквимолярном соотношении с последующей достройкой полимеразой Pfu или обратной транскриптазой Mu-MLV (Promega, США). Далее проводилась обработка ДНК-дуплекса эндонуклеазой рестрикции NdeI с последующим клонированием в вектор pET23, обработанный эндонуклеазами рестрикции NdeI и Ecl136II. Параллельно на матрице геномной ДНК B. subtilis AJ73 была проведена ПЦР-амплификация фрагмента, содержащего промотор гена wprА с праймерами Wpr1 и Wpr2 (рис. 3б).

Далее проводилась обработка продукта ПЦР эндонуклеазами рестрикции BglII и XbaI и лигирование с плазмидной ДНК конструкции на базе вектора pET23, несущей мини-ген Е-пептида устойчивости к эритромицину (рис. 3в).

После этого осуществлялся перенос фрагмента ДНК, содержащего промотор гена wprА и мини-ген Е-пептида, в базовые конструкции pQE-SLN, pQE-GHRH и pQE-PACAP. Для этого проводилась обработка ДНК конструкций эндонуклеазами рестрикции XhoI и EcoRI, препаративная очистка фрагмента конструкции pET23-wprA-mE длиной 999 п.н. элюцией из агарозного геля и последующее лигирование очищенного фрагмента с расщепленной и очищенной фенольной экстракцией плазмидной ДНК конструкций pQE-SLN, pQE-GHRH или pQE-PACAP. Полученные конструкции pQEwprA-mE-SLN (рис. 4), pQE-wprA-mE-GHRH (рис. 5а) и pQE-wprA-mE-PACAP (рис. 5б) вводили в клетки штамма B. subtilis AJ73 (ВКПМ B-5036) методом химической трансформации [1].

Для детекции трансгенов была выделена геномная ДНК из культур клеток B. subtilis AJ73 и проведена ПЦР с использованием разработанных праймеров для получения продуктов амплификации, включающих последовательности фрагментов генов полноразмерного соматолиберина и его предшественников. Аутентичность продуктов ПЦР в виде фрагментов генов полноразмерного зрелого гормона соматолиберина SLN и производных предшественника соматолибери- напептидов GHRH и PACAP, была проконтролирована прямым секвенированием.

Заключение

Таким образом, в настоящей работе предложен способ получения интегративных генетических конструкций для экспрессии гена полноразмерного зрелого гормона соматолиберина SLN и его предшественников - пептидов GHRH и PACAP, в бактериях для дальнейшего перорального введения птицам в составе пробиотического препарата на основе B. subtilis с целью получения анаболического эффекта.

• Кузьмин В.А., д.х.н., зав. лабораторией ИБХФ РАН, ГУ Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН, г. Москва;
• Варгин В.В., д.м.н., доцент, ведущий научный сотрудник, ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН РФ, Московская обл.

Работа поступила в редакцию 13.03.2012