Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Белякова А.В. 1, 2, 3 Эпова Е.Ю. 3 Гра О.А. 4 Зылькова М.В. 2, 4 Плаксина А.Г. 2, 5 Смирнова М.С. 2 Елагина Е.М. 6 Филимонова Н.А. 2, 7 Хасанова А.Р. 5 Смирнова А.В. 5 Казеева Т.Н. 5 Шибаева А.В. 2, 7 Шевелев А.Б. 2 Алешин В.В. 3, 5

---

1 ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных», Казань

2 ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова» РАМН, РФ, Московская обл. поселок сельского типа Институт полиомиелита

3 ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», Москва

4 ФГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет», Москва

5 ФГБОУ ВПО «Набережночелнинский институт социально-педагогических технологий и ресурсов», Набережные Челны

6 ГОУ ВПО «Смоленский государственный университет», Смоленск

7 УРАН «Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля», Москва

Разработка методов перорального введения пептидных ростовых факторов сельскохозяйственным животным, в частности, в составе рекомбинантных пробиотических препаратов, может рассматриваться в качестве перспективного подхода к снижению себестоимости животноводческой продукции и обеспечения конкурентоспособности ее производства. Одним из наиболее эффективных в этом отношении средств является соматолиберин – релизинг-фактор гормона роста. В связи с этим целью работы было создание новых векторных систем для экспрессии полусинтетических генов соматолиберина курицы, способных стабильно функционировать в составе бациллярных штаммов со свойствами пробиотиков. Получены три конструкции, содержащие промотор гена wprА, мини-ген Е-пептида и производные гена соматолиберина, кодирующие либо пептид-предшественник (слитые GHRH и PACAP), либо фрагменты, соответствующие изолированным пептидным гормонам GHRH и PACAP. Сконструированы штаммы B. subtilis, несущие эти конструкции. Таким образом, созданы перспективные продуценты пептидных гормонов, позволяющие проводить испытания биологической активности живых пробиотических препаратов, содержащих производные соматолиберина птицы во внутриклеточной форме, путём их перорального введения.

Статья в формате PDF

913 KB

птицеводство

анаболический эффект

соматолиберин

B. subtilis

SLN

GHRH

PACAP

1. Anagnostopoulos C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis / Anagnostopoulos C., Spizizen J. // J. Bacteriol. – 1961. – Vol. 81. – P. 741–746.

2. Iwasaki Y. Characterization of the putative alpha subunit of a heterotrimeric G protein in rice / Iwasaki Y., Kato T., Kaidoh T., Ishikawa A., Asahi T. // Plant Mol. Biol. – 1997. – № 4. – P. 563–572.

3. Kahn C.M. The Merck Veterinary Manual, 10th Edition / Kahn C.M., Line S. – Merck & Co., Inc. – New York, 2010.

4. McRory G.E. Expression and Alternative Processing of a Chicken Gene Encoding Both Growth Hormone-Releasing Hormone and Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide / G.E. McRory, R.L. Parker, N.M. Sherwood // DNA and Cell Biology. – 1997. – Vol. 16, №1. – P. 95–102.

5. Peric L. Aplication of alternative growth promoters in broiler production / Peric L., Zikic D., Lukic M. // Biotechnology in Animal Husbandry. – 2009. – Vol. 25, № 5-6. – Р. 387–397.

6. Rojas Contreras J.A. Replicative and integrative plasmids for production of human interferon gamma in Bacillus subtilis / Rojas Contreras J.A., Pedraza-Reyes M., Ordoñez L.G., Estrada N.U., Barba de la Rosa A.P., De León-Rodríguez A. // Plasmid. – 2010. – Vol. 64, № 3. – P. 170–176.

7. Sambrook J. Molecular cloning / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis – Cold Spring Harbor Laboratory press. – New York, 1989.

В настоящее время применение стимуляторов роста на птицеводческих предприятиях приобрело массовый характер и является важнейшим фактором снижения себестоимости продукции и обеспечения ее конкурентоспособности в условиях быстрого роста производства. В то же время получение очищенных субстанций ростовых факторов, пригодных для парентерального применения, остается дорогостоящим в применении и требует длительных сроков на разработку. В результате птицеводческим хозяйствам приходится прибегать к массовому применению потенциально опасных для потребителя химических средств стимулирования роста: синтетическим стероидным гормонам [3]. Экономически эффективной и безо­пасной для человека альтернативой этому укоренившемуся на практике подходу является разработка живых вакцин и продуцентов ростовых факторов на базе полностью безопасных микроорганизмов, обладающих естественной антагонистической активностью к энтеропатогенам, в частности, мезофильных видов бацилл [5]. Этот подход не является полностью новым: в течение многих лет он оправдывает себя в ходе применения пробиотических штаммов, большинство из которых являются природными продуцентами бактерицидных пептидов.

Эти штаммы представляют собой экономически эффективный и полностью безопасный заменитель антибиотиков. Применение таких штаммов в качестве добавки в корм вызывает пролонгированный эффект подавления патогенной микрофлоры, в то же время, улучшая метаболический потенциал среды кишечника за счет синтеза витаминов, полисахаридов и других биологически активных веществ. В совокупности применение пробиотиков в птицеводстве существенно снижает смертность поголовья, приводя к повышению суточных привесов [5]. Введение в геном эффективных пробиотических штаммов бацилл генов ростовых факторов, в частности, гена соматолиберина, может существенно дополнить и расширить лечебно-профилактический эффект от их применения, практически не увеличивая затраты на получение препаратов по сравнению с традиционными штаммами.

Существенным фактором, осложняющим практическое использование потенциала пробиотических препаратов на основе бацилл, является несовершенство экспрессионных систем введения чужеродных генов в эти микроорганизмы. Существующие плазмидные векторы для бацилл не обладают достаточной репликативной и физиологической стабильностью. Кроме того, введение в организм сельскохозяйственных животных внехромосомных генетических элементов нежелательно с точки зрения биобезопасности [6].

Целью настоящей работы явилось создание новых векторных систем для экспрессии полусинтетических генов соматолиберина курицы, способных стабильно функционировать в составе бациллярных штаммов при получении бактерийного препарата пробиотического назначения в промышленных условиях и пригодного для применения на отечественных птицеводческих предприятиях.

Материалы и методы исследования

Для конструирования рекомбинантных пробиотических штаммов бацилл был разработан и синтезирован вариант гена соматолиберина курицы, оптимизированный для экспрессии в бактериях. Для этого с помощью ПЦР из генома курицы были клонированы два экзона гена соматолиберина [4], которые затем были сшиты и введены в состав вектора pQE30 (Qiagen, США). Геномная ДНК курицы была выделена из мышечной ткани методом фенольной экстракции [2, 7]. Полученная базовая конструкция pQE-SLN была использована для амплификации искусственных генов, кодирующих производные предшественника соматолиберина (пептиды GHRH и PACAP) с последующим введением ПЦР-продуктов желаемой последовательности в состав вектора pQE30 и получением конструкций pQE-GHRH и pQE-PACAP. Полученные конструкции использовали для получения интегративных векторов для экспрессии в клетках B. subtilis. Для этого в конструкцию pQE-SLN вводили промотор гена WprA B. subtilis и мини-ген Е-пептида устойчивости к эритромицину. Правильность трансгенной вставки контролировали посредством прямого секвенирования.

На основании известной интрон-экзонной организации гена соматолиберина курицы были сконструированы две пары праймеров SLN1-SLN2 и SLN3-SLN4 (рис. 1). Праймеры позволяли получить ген соматолиберина, кодирующий полноразмерный зрелый гормон без пропептида и секреторного лидера, аминокислотная последовательность которого соответствует сплайсоформе I первичного транскрипта. На 5'-конец праймера SLN3 была введена последовательность из 20 нуклеотидов, комплементарная праймеру SLN2, что позволяло продуктам ПЦР, полученным с использованием праймеров SLN2 и SLN3, взаимно отжигаться друг с другом. С помощью пары праймеров SLN1-SLN2 на матрице геномной ДНК курицы был получен продукт размером 104 п.н., включающий последовательность II экзона гена соматолиберина, а с помощью пары праймеров SLN3-SLN4 - продукт размером 241 п.н., соответствующий III экзону того же гена.

Первичные продукты ПЦР были очищены элюцией из агарозного геля, объединены и использованы в качестве матрицы для проведения ПЦР с праймерами SLN1-SLN4. В результате был получен продукт размером 325 п.н. После элюции из агарозного геля он был обработан рестриктазами BamHI и SalI и клонирован в вектор pQE30, предварительно расщепленный по сайтам BamHI и SalI. В итоге была отобрана конструкция pQE-SLN, содержащая ген соматолиберина желаемой последовательности.

Полученная конструкция pQE-SLN дала высокую продукцию рекомбинантного белка, который был очищен до гомогенного состояния. Поскольку максимальная эффективность действия соматолиберина достигается только в присутствии агониста - аденилатциклаза-активи­рую­щего пептида (PACAP), а в геноме млекопитающих ген PACAP существует независимо от гена соматолиберина (GHRH), разработанную конструкцию pQE-SLN использовали в качестве исходной для получения искусственных генов, кодирующих производные предшественника соматолиберина - пептиды GHRH (рис. 2а) и PACAP (рис. 2б).

На матрице pQE-SLN был проведен ПЦР с праймерами SLN1-SLN102 (размер продукта 156 п. н.) и праймерами SLN101-SLN4 (размер продукта 181 п. н.). После элюции из агарозного геля эти продукты были обработаны рестриктазами BamHI и SalI и клонированы в вектор pQE30, предварительно расщепленный по сайтам BamHI и SalI. В итоге были отобраны конструкции pQE-GHRH и pQE-PACAP, содержащие последовательности генов пептидов GHRH и PACAP, соответственно.

Полученные базовые конструкции pQE-SLN, pQE-GHRH и pQE-PACAP были использованы для получения интегративных векторов для экспрессии в клетках B. subtilis. Для этого в конструкции вводили промотор гена WprA B. subtilis, служивший одновременно плечом для гомологичной рекомбинации при интеграции в геном бактерии, и мини-ген Е-пептида, придающий бациллам устойчивость к эритромицину.

ДНК-дуплекс искусственного мини-гена Е-пептида был получен с использованием праймеров Em1 и Em2 (рис. 3а) в эквимолярном соотношении с последующей достройкой полимеразой Pfu или обратной транскриптазой Mu-MLV (Promega, США). Далее проводилась обработка ДНК-дуплекса эндонуклеазой рестрикции NdeI с последующим клонированием в вектор pET23, обработанный эндонуклеазами рестрикции NdeI и Ecl136II. Параллельно на матрице геномной ДНК B. subtilis AJ73 была проведена ПЦР-амплификация фрагмента, содержащего промотор гена wprА с праймерами Wpr1 и Wpr2 (рис. 3б).

Далее проводилась обработка продукта ПЦР эндонуклеазами рестрикции BglII и XbaI и лигирование с плазмидной ДНК конструкции на базе вектора pET23, несущей мини-ген Е-пептида устойчивости к эритромицину (рис. 3в).

После этого осуществлялся перенос фрагмента ДНК, содержащего промотор гена wprА и мини-ген Е-пептида, в базовые конструкции pQE-SLN, pQE-GHRH и pQE-PACAP. Для этого проводилась обработка ДНК конструкций эндонуклеазами рестрикции XhoI и EcoRI, препаративная очистка фрагмента конструкции pET23-wprA-mE длиной 999 п.н. элюцией из агарозного геля и последующее лигирование очищенного фрагмента с расщепленной и очищенной фенольной экстракцией плазмидной ДНК конструкций pQE-SLN, pQE-GHRH или pQE-PACAP. Полученные конструкции pQEwprA-mE-SLN (рис. 4), pQE-wprA-mE-GHRH (рис. 5а) и pQE-wprA-mE-PACAP (рис. 5б) вводили в клетки штамма B. subtilis AJ73 (ВКПМ B-5036) методом химической трансформации [1].

Для детекции трансгенов была выделена геномная ДНК из культур клеток B. subtilis AJ73 и проведена ПЦР с использованием разработанных праймеров для получения продуктов амплификации, включающих последовательности фрагментов генов полноразмерного соматолиберина и его предшественников. Аутентичность продуктов ПЦР в виде фрагментов генов полноразмерного зрелого гормона соматолиберина SLN и производных предшественника соматолибери- напептидов GHRH и PACAP, была проконтролирована прямым секвенированием.

Заключение

Таким образом, в настоящей работе предложен способ получения интегративных генетических конструкций для экспрессии гена полноразмерного зрелого гормона соматолиберина SLN и его предшественников - пептидов GHRH и PACAP, в бактериях для дальнейшего перорального введения птицам в составе пробиотического препарата на основе B. subtilis с целью получения анаболического эффекта.

• Кузьмин В.А., д.х.н., зав. лабораторией ИБХФ РАН, ГУ Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН, г. Москва;
• Варгин В.В., д.м.н., доцент, ведущий научный сотрудник, ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН РФ, Московская обл.

Работа поступила в редакцию 13.03.2012

Библиографическая ссылка