Диффузное поражение миокарда, развивающееся чаще всего при миокардитах различной этиологии и кардиомиопатиях, является причиной глубоких расстройств внутрисердечной и системной гемодинамики, обусловленных резким снижением систолической и диастолической функции сердца, а также теми или иными нарушениями проводимости. Поиск непосредственных причин, способствующих снижению количества функционально полноценных клеток миокарда, представляет собой одну из важнейших проблем современных фундаментальных исследований в области кардиологии. В последние годы активно изучаются механизмы, лежащие в основе генетически запрограммированной гибели кардиомиоцитов (КМЦ) при воспалительных и дистрофических заболеваниях сердечной мышцы. Так, в ряде работ показано, что интенсивность апоптоза КМЦ значительно увеличивается при вирусном миокардите [5, 6, 9, 10]. Также установлена активация апоптотических процессов в миокарде при экспериментальном боррелиозе, вызванном изогенным серотипом Borrelia turicatae [8]. Однако, по данным G. Wang et al. [13], при развитии миокардита, обусловленного Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumonia, признаки усиления апоптоза КМЦ отсутствуют. Использование тонких методов детекции маркёров апоптоза позволило ряду авторов выявить роль апоптотических механизмов в развитии дилатационной кардиомиопатии [2, 3, 7], а также аритмогенной правожелудочковой дисплазии [1]. Вопрос об участии программированной гибели КМЦ в патогенезе гипертрофической и рестриктивной кардиомиопатии остаётся малоизученным. Следует отметить, что анализ апоптотических процессов зачастую проводится на основании какого-либо одного специфического маркёра, что не всегда позволяет судить о предпринимается попытка оценить особенности апоптотической гибели КМЦ при одном из наиболее тяжёлых видов диффузного поражения сердца - дифтерийном миокардите - методом сопоставления данных биохимического и иммуногистохимического исследования.
Цель исследования - изучить интенсивность и возможные механизмы апоптоза КМЦ левого и правого желудочков (ЛЖ и ПЖ) сердца в динамике экспериментального диффузного токсического поражения миокарда методом TUNEL-анализа и оценки активности каспазы 3.
Материал и методы исследования
Эксперимент проводили на 32 кроликах-самцах породы «Шиншилла» массой тела 3-3,5 кг в двух параллельных сериях, каждая из которых включала 4 группы: 1 контрольную (интактные животные) и 3 опытных (диффузное токсическое поражение миокарда, обусловленное дифтерийной интоксикацией, на сроках 1, 3 и 5 сут). Дифтерийную интоксикацию моделировали путём однократного внутривенного введения кроликам нативного дифтерийного токсина в дозе 0,3 DLM (dosis letalis minima), предварительно оттитрованного на морских свинках.
В первой серии исследования проводили иммуногистохимическую оценку апоптоза КМЦ. Каждая группа включала в себя 3 кролика. Образцы миокарда ЛЖ и ПЖ фиксировали в течение 72 часов в 4%-м нейтральном параформальдегиде. Далее проводили обработку материала и заливку в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы толщиной 5 мкм изготавливали на микротоме «Slidt-2003» (Германия) и наносили на стёкла с поли-L-лизиновым покрытием. Срезы депарафинировали ксилолом и проводили по спиртам нисходящей концентрации. Апоптоз КМЦ оценивали путём постановки реакции TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) с использованием стандартного набора реактивов Apo-BrdU-IHC In Situ DNA Fragmentation Assay Kit (BioVision, США). Препараты докрашивали гематоксилином. Реакция TUNEL считалась положительной при появлении коричневой окраски в ядрах КМЦ. Визуальный анализ препаратов миокарда выполняли с помощью светового микроскопа «Nikon Eclipse E400» при увеличении 400х и видеосистемы «TauVideo» с программой «Тау Морфология» на основе видеокамеры «Watec 221s». При этом анализировали 50 полей зрения в каждом препарате. Количественный анализ интенсивности апоптоза КМЦ выполняли методом расчёта индекса апоптоза, представляющего собой отношение числа TUNEL-позитивных ядер КМЦ к общему количеству ядер КМЦ в поле зрения.
Во второй серии исследования определяли активность казпазы 3 в миокарде кроликов. Каждая группа включала в себя 5 кроликов. Ткань миокарда отдельно ЛЖ и ПЖ измельчали в гомогенизаторе WiseTis серии HG-15 с ротором 8 мм при скорости 4500 об/мин. Для этого использовали среду выделения (20 мM HEPES, pH 7,5, 10 мM KCl, 1,5 мM MgCl2, 1 мM ДТТ), к которой добавляли коктейль ингибиторов протеаз (104 мM AEBSF, 0,08 мМ апротинин, 1,5 мМ пепстатин А, 2 мМ лейпептин, 4 мМ бестатин, 1,4 мМ Е-64) в соотношении 100:1 (все реактивы были произведены фирмой «Sigma», CША). Гомогенаты центрифугировали на микроцентрифуге Heraeus fresco 17 (Thermo Electron LED GMBH, Германия) при 15000 g в течение 30 мин при 4°. В полученных супернатантах оценивали активность каспазы 3 колориметрическим методом по скорости расщепления синтетического субстрата Ac-DEVD-pNA (N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-нитроанилин, «Sigma», США). Супернатант инкубировали в 96-луночных микропланшетах в течение 95 мин при 37°С в реакционном буфере (20 мМ HEPES, pH 7,4, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 0,1% CHAPS) в двух параллельных пробах, одна из которых содержала 20 нмоль Ac-DEVD-pNA, а другая - 20 нмоль Ac-DEVD-pNA и 2 нмоль специфического ингибитора каспазы 3 Ac-DEVD-CHO. Оптическую плотность регистрировали каждые 10 мин на ИФА-ридере Sunrise (Tecan) при длине волны 405 нм. Активность каспазы 3 рассчитывали по разнице скоростей расщепления субстрата в пробах без ингибитора и в присутствии ингибитора с учетом калибровочной кривой оптической плотности стандарта pNA.
Содержание животных и работа с ними проводились в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программ «Microsoft Excel» и «Biostat». Для каждого показателя вычисляли среднее значение, стандартную ошибку среднего. Достоверность отличий рассчитывали на основе t-критерия Стьюдента. Разность считалась достоверной при p ≤ 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Согласно данным иммуногистохимического исследования, в миокарде ЛЖ в контрольной группе отмечается небольшое количество TUNEL-позитивных КМЦ. При этом индекс апоптоза составляет 0,14 (рис. 1). На 1-е сутки эксперимента число ядер КМЦ с положительной окраской заметно увеличивается, а индекс апоптоза становится достоверно выше контрольного уровня, достигая 0,2. В последующие сроки исследования (3-и и 5-е сутки) тенденция к росту количества TUNEL-позитивных ядер КМЦ сохраняется: индекс апоптоза приобретает значения 0,22 и 0,24 соответственно.
В ПЖ, равно как и в ЛЖ, в контроле количество TUNEL-позитивных ядер КМЦ незначительно. Индекс апоптоза также равен 0,14 (рис. 2). На 1-е сутки дифтерийной интоксикации индекс апоптоза достоверно от контрольного уровня не отличается. К 3-м суткам число положительно окрашенных ядер КМЦ увеличивается, что подтверждается статистически значимым повышением индекса апоптоза: он становится равен 0,19. Однако на 5-е сутки число апоптотически изменённых ядер КМЦ существенно уменьшается относительно 3-х суток, а индекс апоптоза возвращается к исходному уровню.
Таким образом, диффузное повреждение миокарда, вызванное воздействием на сердце дифтерийного токсина, сопровождается увеличением интенсивности апоптоза КМЦ в обоих желудочках сердца, однако, динамика активности апоптотических процессов в ЛЖ и ПЖ отличается.
?
Рис. 1. Индекс апоптоза КМЦ ЛЖ сердца при дифтерийной интоксикации (отношение числа TUNEL-позитивных ядер к общему количеству ядер). Планки погрешностей - ошибки среднего (в%). * p ≤ 0,05 по сравнению с контрольной группой
?
Рис. 2. Индекс апоптоза КМЦ ПЖ сердца при дифтерийной интоксикации (отношение числа TUNEL-позитивных ядер к общему количеству ядер). Планки погрешностей - ошибки среднего (в%). * p ≤ 0,05 по сравнению с контрольной группой
Обратимся к данным биохимического исследования апоптоза клеток миокарда ЛЖ и ПЖ. Как видно из результатов, представленных в таблице, в миокарде ЛЖ активность каспазы 3 достоверно повышается по сравнению с контролем лишь на 5-е сутки эксперимента. При этом в миокарде ПЖ статистически значимого отличия по данному показателю не наблюдается ни на одном из сроков исследования.
Активность каспазы 3 в миокарде желудочков сердца кроликов при дифтерийной интоксикации, нмоль/мин/мл (M ± m)
|
Показатель |
Контроль |
1-е сутки |
3-и сутки |
5-е сутки |
|
ЛЖ |
0,11 ± 0,01 |
0,1 ± 0,02 |
0,14 ± 0,01 |
0,15 ± 0,01* |
|
ПЖ |
0,09 ± 0,02 |
0,1 ± 0,02 |
0,11 ± 0,04 |
0,08 ± 0,02 |
Примечание: звёздочкой отмечены показатели, достоверно отличающиеся от контроля при p ≤ 0,05.
Сравнение результатов эксперимента, полученных в первой и второй сериях, свидетельствует о том, что при дифтерийном поражении сердца усиление фрагментации ДНК в ядрах КМЦ обоих желудочков возможно без активации каспазы 3. Так, в ЛЖ количество TUNEL-позитивных ядер увеличено по сравнению с контрольной группой на всех сроках, тогда как активность каспазы 3 повышается лишь на 5-е сутки. В ПЖ активность каспазы 3 остаётся на уровне контроля на всём протяжении исследования, однако, на 3-и сут наблюдается увеличение ядер КМЦ с положительной реакцией TUNEL.
В связи с этим можно сделать два предположения. Во-первых, активация апоптотических процессов в клетках миокарда может осуществляться, минуя каспазу 3 за счёт иных каспазных ферментов, например, каспазы 7, которая в данном исследовании не определялась. Кроме того, индукция апоптоза КМЦ может быть обусловлена и некаспазными механизмами. В частности, известно, что под действием апоптогенного сигнала из митохондрий высвобождается фактор AIF (apoptosis inducing factor) [4], активирующий эндонуклазу [4, 11, 12] и способный самостоятельно обеспечивать конденсацию хроматина и фрагментацию нуклеиновых кислот [12].
Заключение
При диффузном поражении сердца, обусловленном дифтерийной интоксикацией, в миокарде обоих желудочков активируются апоптотические процессы. При этом можно предположить, что индукция апоптоза КМЦ в ЛЖ связана с активацией каспазы 3 лишь на 5-х сутках эксперимента, а в первые 3-е суток, равно как и в ПЖ на всём протяжении исследования, передача апоптогенного сигнала осуществляется либо за счёт других эффекторных ферментов каспазного каскада, либо посредством некаспазных механизмов.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
Рецензенты:
-
Рапопорт С.И., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией «Хрономедицина и новые технологии в клинике внутренних болезней» ГБОУ ВПО «Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития РФ, г. Москва;
-
Тюрин В.В., д.б.н., доцент, и.о. зав. кафедрой генетики, микробиологии и биотехнологии ФГБОУ «Кубанский государственный университет» Минобрнауки России, г. Краснодар.
Работа поступила в редакцию 23.04.2012.