Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Благонравов М.Л. 1 Азова М.М. 1 Ковязин В.А. 1 Бабиченко И.И. 1 Фролов В.А. 1

---

1 ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки России, Москва

В данной работе изучались интенсивность и возможные механизмы апоптоза кардиомиоцитов левого и правого желудочков сердца при экспериментальном диффузном токсическом поражении миокарда методом TUNEL-анализа и оценки активности каспазы 3. У кроликов моделировали дифтерийную интоксикацию путём внутривенного введения нативного дифтерийного токсина. Далее исследование проводили на сроках 1, 3 и 5 суток. Установлено, что в левом желудочке количество TUNEL-позитивных ядер кардиомиоцитов увеличено на всех сроках эксперимента, однако, активность каспазы 3 достоверно повышалась лишь на 5-е сутки. В правом желудочке количество TUNEL-позитивных ядер увеличивалось на 3-и сутки, а к 5-м суткам возвращалось на уровень контроля. При этом активность каспазы 3 не имела статистически значимого отличия от контроля ни на одном из сроков исследования. Таким образом, при диффузном поражении сердца, обусловленном дифтерийной интоксикацией, в миокарде обоих желудочков активируются апоптотические процессы. Можно предположить, что индукция апоптоза кардиомиоцитов в левом желудочке связана с активацией каспазы 3 лишь на 5-х сутках эксперимента, а в первые 3-е суток, равно как и в правом желудочке на всём протяжении исследования, передача апоптогенного сигнала осуществляется либо за счёт других эффекторных ферментов каспазного каскада, либо посредством некаспазных механизмов.

Статья в формате PDF

296 KB

дифтерийная интоксикация

апоптоз

кардиомиоцит

миокард

каспаза

TUNEL

1. Цыпленкова В.Г., Воробьёв А.А. Ультраструктурная и иммуногистохимическая характеристика механизма гибели кардиомиоцитов при аритмогенной дисплазии правого желудочка // Архив патологии. – 2007. – Т. 69, № 6. – С. 3–7.

2. Aharinejad S., Andrukhova O., Lucas T., Zuckermann A., Wieselthaler G., Wolner E., Grimm M. // Ann. Thorac. Surg. – 2008. – Vol. 86, № 1. – P. 109–114.

3. Birks E.J., Latif N., Enesa K., Folkvang T., Luong le A., Sarathchandra P., Khan M., Ovaa H., Terracciano C.M., Barton P.J., Yacoub M.H., Evans P.C. // Cardiovasc. Res. – 2008. – Vol. 79, № 3. – P. 472–480.

4. Daugas E., Nochy D., Ravagnan L., Loeffler M., Susin S.A., Zamzami N., Kroemer G. // FEBS Lett. – 2000. – Vol. 476, № 3. – P. 118–123.

5. DeBiasi R.L., Robinson B.A., Leser J.S., Brown R.D., Long C.S., Clarke P. // J. Card. Fail. – 2010. – Vol. 16, № 11. – P. 901–910.

6. Hu X., Wang H., Lu W., Dong Y., Cheng P. // J. Tongji Med. Univ. – 2001. – Vol. 21, № 3. –P. 256–258.

7. Ibe W., Saraste A., Lindemann S., Bruder S., Buerke M., Darius H., Pulkki K., Voipio-Pulkki L.M. // Eur. J. Heart Fail. – 2007. – Vol. 9, № 2. – P. 160–167.

8. Londoño D., Bai Y., Zückert W.R., Gelderblom H., Cada­vid D. // Infect. Immun. – 2005. – Vol. 73, № 11. –P. 7669–7676.

9. Mihatsch K., Nestler M., Saluz H.P., Henke A., Munder T. // Cardiovasc. Res. – 2009. – Vol. 81, № 1. – P. 108–115.

10. Shen Y., Kan Q.C., Xu W., Chu Y.W., Xiong S.D. // Iran J. Allergy Asthma Immunol. – 2009. – Vol, 8. № 1. – P. 1–9.

11. Susin S.A., Daugas E., Ravagnan L., Samejima K., Zamzami N., Loeffler M., Costantini P., Ferri K.F., Irinopoulou T., Prévost M.C., Brothers G., Mak T.W., Penninger J., Earnshaw W.C., Kroemer G. // J. Exp. Med. – 2000. – Vol. 192, № 4. – P. 571–580.

12. Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N., Marzo I., Snow B.E., Brothers G.M., Mangion J., Jacotot E., Costantini P., Loeffler M., Larochette N., Goodlett D.R., Aebersold R., Siderovski D.P., Penninger J.M., Kroemer G. // Nature. –

1999. –Vol. 397, № 6718. – P. 441–446.

13. Wang G., Burczynski F., Hasinoff B., Zhong G. // Microbiology. – 2002. –148. № Pt12. – P. 3955–3959.

Диффузное поражение миокарда, развивающееся чаще всего при миокардитах различной этиологии и кардиомиопатиях, является причиной глубоких расстройств внутрисердечной и системной гемодинамики, обусловленных резким снижением систолической и диастолической функции сердца, а также теми или иными нарушениями проводимости. Поиск непосредственных причин, способствующих снижению количества функционально полноценных клеток миокарда, представляет собой одну из важнейших проблем современных фундаментальных исследований в области кардиологии. В последние годы активно изучаются механизмы, лежащие в основе генетически запрограммированной гибели кардиомиоцитов (КМЦ) при воспалительных и дистрофических заболеваниях сердечной мышцы. Так, в ряде работ показано, что интенсивность апоптоза КМЦ значительно увеличивается при вирусном миокардите [5, 6, 9, 10]. Также установлена активация апоптотических процессов в миокарде при экспериментальном боррелиозе, вызванном изогенным серотипом Borrelia turicatae [8]. Однако, по данным G. Wang et al. [13], при развитии миокардита, обусловленного Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumonia, признаки усиления апоптоза КМЦ отсутствуют. Использование тонких методов детекции маркёров апоптоза позволило ряду авторов выявить роль апоптотических механизмов в развитии дилатационной кардиомиопатии [2, 3, 7], а также аритмогенной правожелудочковой дисплазии [1]. Вопрос об участии программированной гибели КМЦ в патогенезе гипертрофической и рестриктивной кардиомиопатии остаётся малоизученным. Следует отметить, что анализ апоптотических процессов зачастую проводится на основании какого-либо одного специфического маркёра, что не всегда позволяет судить о предпринимается попытка оценить особенности апоптотической гибели КМЦ при одном из наиболее тяжёлых видов диффузного поражения сердца - дифтерийном миокардите - методом сопоставления данных биохимического и иммуногистохимического исследования.

Цель исследования - изучить интенсивность и возможные механизмы апоптоза КМЦ левого и правого желудочков (ЛЖ и ПЖ) сердца в динамике экспериментального диффузного токсического поражения миокарда методом TUNEL-анализа и оценки активности каспазы 3.

Эксперимент проводили на 32 кроликах-самцах породы «Шиншилла» массой тела 3-3,5 кг в двух параллельных сериях, каждая из которых включала 4 группы: 1 контрольную (интактные животные) и 3 опытных (диффузное токсическое поражение миокарда, обусловленное дифтерийной интоксикацией, на сроках 1, 3 и 5 сут). Дифтерийную интоксикацию моделировали путём однократного внутривенного введения кроликам нативного дифтерийного токсина в дозе 0,3 DLM (dosis letalis minima), предварительно оттитрованного на морских свинках.

В первой серии исследования проводили иммуногистохимическую оценку апоптоза КМЦ. Каждая группа включала в себя 3 кролика. Образцы миокарда ЛЖ и ПЖ фиксировали в течение 72 часов в 4%-м нейтральном параформальдегиде. Далее проводили обработку материала и заливку в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы толщиной 5 мкм изготавливали на микротоме «Slidt-2003» (Германия) и наносили на стёкла с поли-L-лизиновым покрытием. Срезы депарафинировали ксилолом и проводили по спиртам нисходящей концентрации. Апоптоз КМЦ оценивали путём постановки реакции TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) с использованием стандартного набора реактивов Apo-BrdU-IHC In Situ DNA Fragmentation Assay Kit (BioVision, США). Препараты докрашивали гематоксилином. Реакция TUNEL считалась положительной при появлении коричневой окраски в ядрах КМЦ. Визуальный анализ препаратов миокарда выполняли с помощью светового микроскопа «Nikon Eclipse E400» при увеличении 400х и видеосистемы «TauVideo» с программой «Тау Морфология» на основе видеокамеры «Watec 221s». При этом анализировали 50 полей зрения в каждом препарате. Количественный анализ интенсивности апоптоза КМЦ выполняли методом расчёта индекса апоптоза, представляющего собой отношение числа TUNEL-позитивных ядер КМЦ к общему количеству ядер КМЦ в поле зрения.

Во второй серии исследования определяли активность казпазы 3 в миокарде кроликов. Каждая группа включала в себя 5 кроликов. Ткань миокарда отдельно ЛЖ и ПЖ измельчали в гомогенизаторе WiseTis серии HG-15 с ротором 8 мм при скорости 4500 об/мин. Для этого использовали среду выделения (20 мM HEPES, pH 7,5, 10 мM KCl, 1,5 мM MgCl2, 1 мM ДТТ), к которой добавляли коктейль ингибиторов протеаз (104 мM AEBSF, 0,08 мМ апротинин, 1,5 мМ пепстатин А, 2 мМ лейпептин, 4 мМ бестатин, 1,4 мМ Е-64) в соотношении 100:1 (все реактивы были произведены фирмой «Sigma», CША). Гомогенаты центрифугировали на микроцентрифуге Heraeus fresco 17 (Thermo Electron LED GMBH, Германия) при 15000 g в течение 30 мин при 4°. В полученных супернатантах оценивали активность каспазы 3 колориметрическим методом по скорости расщепления синтетического субстрата Ac-DEVD-pNA (N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-нитроанилин, «Sigma», США). Супернатант инкубировали в 96-луночных микропланшетах в течение 95 мин при 37°С в реакционном буфере (20 мМ HEPES, pH 7,4, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 0,1% CHAPS) в двух параллельных пробах, одна из которых содержала 20 нмоль Ac-DEVD-pNA, а другая - 20 нмоль Ac-DEVD-pNA и 2 нмоль специфического ингибитора каспазы 3 Ac-DEVD-CHO. Оптическую плотность регистрировали каждые 10 мин на ИФА-ридере Sunrise (Tecan) при длине волны 405 нм. Активность каспазы 3 рассчитывали по разнице скоростей расщепления субстрата в пробах без ингибитора и в присутствии ингибитора с учетом калибровочной кривой оптической плотности стандарта pNA.

Содержание животных и работа с ними проводились в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ «Microsoft Excel» и «Biostat». Для каждого показателя вычисляли среднее значение, стандартную ошибку среднего. Достоверность отличий рассчитывали на основе t-критерия Стьюдента. Разность считалась достоверной при p ≤ 0,05.

Согласно данным иммуногистохимического исследования, в миокарде ЛЖ в контрольной группе отмечается небольшое количество TUNEL-позитивных КМЦ. При этом индекс апоптоза составляет 0,14 (рис. 1). На 1-е сутки эксперимента число ядер КМЦ с положительной окраской заметно увеличивается, а индекс апоптоза становится достоверно выше контрольного уровня, достигая 0,2. В последующие сроки исследования (3-и и 5-е сутки) тенденция к росту количества TUNEL-позитивных ядер КМЦ сохраняется: индекс апоптоза приобретает значения 0,22 и 0,24 соответственно.

В ПЖ, равно как и в ЛЖ, в контроле количество TUNEL-позитивных ядер КМЦ незначительно. Индекс апоптоза также равен 0,14 (рис. 2). На 1-е сутки дифтерийной интоксикации индекс апоптоза достоверно от контрольного уровня не отличается. К 3-м суткам число положительно окрашенных ядер КМЦ увеличивается, что подтверждается статистически значимым повышением индекса апоптоза: он становится равен 0,19. Однако на 5-е сутки число апоптотически изменённых ядер КМЦ существенно уменьшается относительно 3-х суток, а индекс апоптоза возвращается к исходному уровню.

Таким образом, диффузное повреждение миокарда, вызванное воздействием на сердце дифтерийного токсина, сопровождается увеличением интенсивности апоптоза КМЦ в обоих желудочках сердца, однако, динамика активности апоптотических процессов в ЛЖ и ПЖ отличается.

?

?

Обратимся к данным биохимического исследования апоптоза клеток миокарда ЛЖ и ПЖ. Как видно из результатов, представленных в таблице, в миокарде ЛЖ активность каспазы 3 достоверно повышается по сравнению с контролем лишь на 5-е сутки эксперимента. При этом в миокарде ПЖ статистически значимого отличия по данному показателю не наблюдается ни на одном из сроков исследования.

Активность каспазы 3 в миокарде желудочков сердца кроликов при дифтерийной интоксикации, нмоль/мин/мл (M ± m)

Примечание: звёздочкой отмечены показатели, достоверно отличающиеся от контроля при p ≤ 0,05.

Сравнение результатов эксперимента, полученных в первой и второй сериях, свидетельствует о том, что при дифтерийном поражении сердца усиление фрагментации ДНК в ядрах КМЦ обоих желудочков возможно без активации каспазы 3. Так, в ЛЖ количество TUNEL-позитивных ядер увеличено по сравнению с контрольной группой на всех сроках, тогда как активность каспазы 3 повышается лишь на 5-е сутки. В ПЖ активность каспазы 3 остаётся на уровне контроля на всём протяжении исследования, однако, на 3-и сут наблюдается увеличение ядер КМЦ с положительной реакцией TUNEL.

В связи с этим можно сделать два предположения. Во-первых, активация апоптотических процессов в клетках миокарда может осуществляться, минуя каспазу 3 за счёт иных каспазных ферментов, например, каспазы 7, которая в данном исследовании не определялась. Кроме того, индукция апоптоза КМЦ может быть обусловлена и некаспазными механизмами. В частности, известно, что под действием апоптогенного сигнала из митохондрий высвобождается фактор AIF (apoptosis inducing factor) [4], активирующий эндонуклазу [4, 11, 12] и способный самостоятельно обеспечивать конденсацию хроматина и фрагментацию нуклеиновых кислот [12].

При диффузном поражении сердца, обу­словленном дифтерийной интоксикацией, в миокарде обоих желудочков активируются апоптотические процессы. При этом можно предположить, что индукция апоптоза КМЦ в ЛЖ связана с активацией каспазы 3 лишь на 5-х сутках эксперимента, а в первые 3-е суток, равно как и в ПЖ на всём протяжении исследования, передача апоптогенного сигнала осуществляется либо за счёт других эффекторных ферментов каспазного каскада, либо посредством некаспазных механизмов.

• Рапопорт С.И., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией «Хрономедицина и новые технологии в клинике внутренних болезней» ГБОУ ВПО «Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития РФ, г. Москва;
• Тюрин В.В., д.б.н., доцент, и.о. зав. кафедрой генетики, микробиологии и биотехнологии ФГБОУ «Кубанский государственный университет» Минобрнауки России, г. Краснодар.

Работа поступила в редакцию 23.04.2012.

Библиографическая ссылка