Лекарственные препараты на основе растительного сырья в настоящее время успешно применяются при лечении большинства заболеваний, так как они обладают рядом преимуществ перед синтетическими лекарственными средствами - широкий выбор терапевтически активных природных соединений в лекарственных растениях, возможность их комбинированного использования, меньшая частота побочных эффектов и противопоказаний. Особый интерес представляют эфирно-масличные растения семейства яснотковые. Они содержат комплекс биологически активных веществ - эфирные масла, иридоиды, тритерпеноиды, полисахариды, фенольные соединения и другие. Многие виды семейства яснотковые накапливают значительное количество тритерпеноидов, которые близки структурно и генетически к стероидам. Особый интерес представляют пентациклические тритерпеновые кислоты - урсоловая и олеаноловая. В сырье некоторых видов иссопа обнаружены урсоловая и олеаноловая кислоты [2]. Урсоловая и олеаноловая кислоты проявляют гепатопротекторную и противовирусную активность (вирус ВИЧ, Эпштейн-Барра, гриппа А и Б), ингибируют рост опухолей. Урсоловая кислота обладает противовоспалительным свойством. По данным испанских ученых она действует не по стероидному механизму и, таким образом, не влияет на водно-солевой обмен подобно глюкокортикоидам и производным глициретовой кислоты [6]. Большинство эфирно-масличных растений семейства яснотковые в настоящее время применяются в качестве отхаркивающих, противовоспалительных, ранозаживляющих и седативных средств. Несмотря на это, многие виды растений семейства яснотковые недостаточно изучены в химическом отношении и имеют ограниченные сведения по фармакологической активности [2, 5].
Целью настоящих исследований явилось изучение качественного состава тритерпеновых соединений иссопа лекарственного и определение количественного содержания тритерпеновых кислот в сырье исследуемого вида.
Объектом исследований являлся иссоп лекарственный (Hyssopus officinalis L.) - культивируемое многолетнее растение, полукустарник с деревянистым стержневым корнем одревесневшими у основания стеблями, высотой 30-80 см. Ввиду того, что растение на территории Северо-Кавказского региона не произрастает, на экспериментальных участках лаборатории лекарственных растений Ставропольского НИИ сельского хозяйства (СНИИСХ) на протяжении пяти лет проводятся исследования по культивированию нескольких ботанических форм иссопа лекарственного (розовая, синяя и белая окраска венчика). Сырье заготавливалось в течение 2004-2006 гг. Для изучения динамики накопления основных групп биологически активных веществ траву иссопа лекарственного заготавливали в различные фазы вегетации растения - бутонизации, массового цветения и плодоношения.
Хлороформные и спиртовые извлечения из сырья иссопа лекарственного показали положительную качественную реакцию Либермана-Бурхарда на тритерпеновую систему ядер. Положительной была также реакция Лафона (табл. 1).
Исследование хлороформных и спиртовых извлечений проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol» и «Sorbfil» в различных системах растворителей: гексан - этилацетат (2:1), хлороформ - этилацетат (9:1), петролейный эфир - хлороформ - кислота уксусная (10:4:0,4). Хроматографирование хлороформных и спиртовых извлечений проводили со стандартами - урсоловой и олеаноловой кислотами.
После хроматографирования влажные пластинки опрыскивали 20 %-м раствором кислоты серной, затем нагревали в сушильном шкафу в течение 8-10 минут при температуре 110 °С. Зоны адсорбции веществ тритерпеновой природы и свидетелей окрашивались в розово-вишневый цвет, переходящий в голубой [1, 4].
Таблица 1
Результаты хроматографического исследования хлороформных и спиртовых извлечений травы иссопа лекарственного
|
Исследуемое извлечение |
Значения Rf зон адсорбции в различных системах растворителей |
|||||
|
гексан-этилацетат (2:1) |
хлороформ-этилацетат (9:1) |
петролейный эфир-хлороформ- кислота уксусная (10:4:0,4) |
||||
|
Sorbfil |
Silufol |
Sorbfil |
Silufol |
Sorbfil |
Silufol |
|
|
Хлороформное |
0,50 |
0,41 |
0,27 |
0,30 |
0,20 0,26 |
0,16 |
|
спирт этиловый 70 % |
---- |
0,27 |
---- |
0,20 |
0,14 |
|
|
Олеаноловая кислота |
0,43 |
0,44 |
0,32 |
0,31 |
0,27 |
0,16 |
|
Урсоловая кислота |
0,45 |
0,40 |
0,27 |
0,27 |
0,23 |
0,13 |
Эксперименты показали, что в хлороформных и 70 %-х спиртовых извлечениях, полученных из травы иссопа лекарственного, присутствуют олеаноловая и урсоловая кислоты. Наилучшее разделение тритерпеноидов происходило в системе петролейный эфир - хлороформ - кислота уксусная (10:4:0,4).
Определение содержания тритерпеновых соединений проводили спектрофотометрическим методом, основанным на реакции с кислотой серной концентрированной, с последующим измерением оптической плотности [3, 4]. Сырье предварительно измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1,0 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 100 мл спирта этилового 40 %, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 60 минут. После охлаждения до комнатной температуры спиртовое извлечение аккуратно сливали. Сырье в колбе заливали 50 мл хлороформа, нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 60 минут, затем охлаждали. Хлороформное извлечение фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, а извлечение хлороформом повторяли, собирая фильтрат в ту же мерную колбу. Доводили хлороформом до метки, перемешивали.
10 мл хлороформного извлечения упаривали до сухого остатка, растворяли в 10 мл кислоты серной концентрированной (точно измеренный объём), периодически взбалтывая. Полученный раствор термостатировали при 70 °С в течение 60 минут. После охлаждения 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили до метки кислотой серной концентрированной.
Стандартный раствор урсоловой кислоты готовили по следующей методике. Около 0,004 г (точная навеска) урсоловой кислоты растворяли в 10 мл (точный объем) кислоты серной концентрированной, периодически взбалтывая. Полученный раствор термостатировали при 70 °С в течение 60 минут, 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили до метки тем же растворителем. Максимум оптической плотности полученного раствора измеряли на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм при длине волны 310 нм. Расчёт содержания суммы тритерпеновых кислот (X, %) в пересчёте на урсоловую кислоту проводили по формуле:
где Dx - оптическая плотность испытуемого раствора; Dст - оптическая плотность стандартного раствора урсоловой кислоты; ax - масса сырья, г; aст - масса урсоловой кислоты, г
Спектры поглощения продуктов взаимодействия концентрированной кислоты серной и тритерпеноидов идентифицировали по характерному максимуму при 310 нм (рисунок).
Параллельно измеряли оптическую плотность стандартного раствора урсоловой кислоты. В качестве раствора сравнения использовали кислоту серную концентрированную. Результаты измерений статистически обработаны.
Содержание тритерпеновых кислот в траве иссопа лекарственного составляет 0,98 ± 0,002 %.
УФ-спектры стандартного раствора урсоловой (1) и олеаноловой (2) кислот
и извлечения иссопа лекарственного (3)
Таблица 2
Содержание тритерпеновых кислот в траве иссопа лекарственного (n = 6)
|
Исследуемое |
Значения оптической |
Содержание тритерпеновых кислот, % |
Метрологические |
|
Иссоп лекарственный |
0,3424 |
1,000 |
S = 0,0038
ε = ±2,27 % |
|
0,3378 |
0,987 |
||
|
0,3419 |
0,999 |
||
|
0,3315 |
0,968 |
||
|
0,3225 |
0,942 |
||
|
0,3393 |
0,991 |
= 0,98;
= 0,009;
= 0,002;
Установлено присутствие олеаноловой и урсоловой кислот в траве иссопа лекарственного, культивируемого в Ставропольском крае. Определено количественное содержание тритерпеновых кислот в пересчёте на урсоловую кислоту в траве иссопа лекарственного - 0,98 ± 0,002 %.
Рецензент -
Молчанов Г.И., д.фарм.н., профессор, кафедры социально-гуманитарных наук Пятигорского филиала ГОУ ВПО Северо-Кавказского ГТУ, г. Пятигорск.
Работа поступила в редакцию 10.10.2011.