Изучение механизмов регуляции гомеостаза является актуальной проблемой современной фундаментальной медицинской науки и предпосылкой для создания средств патогенетической коррекции при различной патологии [2–5]. Ранее нами убедительно продемонстрировано участие эритропоэтина в регуляции гомеостаза при хронической почечной недостаточности (ХПН) в клинических и экспериментальных условиях [6–8]. Одним из неблагоприятных последствий и причиной гнойно-септических осложнений при ХПН является развитие вторичного иммунодефицита, патогенез которого является многофакторным и до конца не изученным. На роль одного из патогенетических факторов претендует вторичный гиперпаратиреоз, и связанные с ним изменения гомеостаза кальция и фосфора могут оказывать влияние на состояние иммуноцитов, регуляцию иммунного ответа. Гиперпаратиреоз и высокие концентрации ПТГ в крови связывают с повышенным риском смертности, в том числе из-за активации эффекторов врожденного иммунитета, эскалации системного воспаления, атеросклероза и кардиоваскулярной патологии, а также депрессии адаптивного иммунитета, приводящей к инфекционным осложнениям [10]. Патогенез изменений иммунного статуса при гиперпаратиреозе до конца не ясен, сведения по этому вопросу крайне противоречивы. Цель работы – исследовать роль процессов свободнорадикального окисления в лимфоцитах периферической крови в патогенезе изменений иммунного статуса при экспериментальном гиперпаратиреозе.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на 72 белых нелинейных крысах-самцах массой 200–220 г, находящихся в стандартных условиях вивария. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись при строгом соблюдении требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента с последующей утилизацией. В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. Гиперпаратиреоз у крыс моделировали содержанием на гиперфосфатной диете по методу H.H. Draper et al. [11] в нашей модификации. В течение 120 дней рацион крыс состоял из синтетической гиперфосфатной смеси (0,6 % кальция и 4,2 % фосфора). Развитие гиперпаратиреоза верифицировали по увеличению концентрации ПТГ в плазме. Кровь для исследований через 120 дней забирали пункцией левого желудочка сердца. В периферической крови общепринятыми методами определяли общее количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу. Поглотительную способность фагоцитов исследовали с частицами монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистирольного латекса, учитывали активность, интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число. Генерацию активных форм кислорода оценивали в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте с учетом активности (% клеток) и интенсивности (у.е.) и расчетом функционального резерва клеток. Оценку гуморального Th2-зависимого иммунного ответа у крыс проводили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, оценку клеточного Th1-зависимого иммунного ответа – по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами. Уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в лимфоцитах определяли спектрофотометрически с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта [1]. Результаты выражали ‒ у.е./мл исследуемой пробы и в единицах индексов окисления (е.и.о.) – Е232/Е220 (относительное содержание диеновых конъюгатов – ДК, первичных продуктов ПОЛ), Е278/Е220 (уровень кетодиенов и сопряженных триенов – КД и СТ, вторичных продуктов ПОЛ) и Е400/Е220 (уровень оснований Шиффа – ШО, конечных продуктов ПОЛ). Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 8.0. Для оценки различий между группами применяли критерии Манна – Уитни, Краскела – Уоллиса, Вальда – Вольфовица, для установления связей между показателями – коэффициент корреляции Спирмена, различия считали значимыми при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Установлено, что при экспериментальном гиперпаратиреозе в периферической крови снижается количество лейкоцитов, абсолютное количество лимфоцитов (табл. 1). Общее количество лейкоцитов не выходит за пределы допустимых референсных значений. Отмечено усиление функциональной активности фагоцитов в периферической крови по способности клеток захватывать частицы латекса и генерации ими активных форм кислорода (табл. 2). Интенсивность фагоцитоза возрастает на 28 %, фагоцитарное число – на 118 %, интенсивность спонтанного НСТ-теста – на 86 %, интенсивность индуцированного НСТ-теста – на 84 %. На 45 % возрастает функциональный резерв фагоцитов в крови, оцениваемый по активности НСТ-теста. Показатели адаптивного иммунитета у крыс при экспериментальном гиперпаратиреозе представлены в табл. 3. Интенсивность реакции ГЗТ, косвенно отражающая интенсивность Th1-зависимого иммунного ответа, снижается на 25 %. Количество антителообразующих клеток в селезенке снижается как в абсолютных величинах (на 54 %), так и в пересчете на 106 ядросодержащих клеток (ЯСК) (на 29 %), что демонстрирует угнетение Th2-зависимого иммунного ответа. Полагаем, что депрессия показателей адаптивного иммунитета в определенной мере обусловлена лимфоцитопенией. При проведении корреляционного анализа нами установлена прямая средней силы статистически значимая связь между количеством лимфоцитов в периферической крови и абсолютным количеством АОК в селезенке (коэффициент корреляции Спирмена R = 0,62; p < 0,05).
Таблица 1
Количественный состав лейкоцитов в периферической крови при экспериментальном гиперпаратиреозе (M ± m)
|
Группы Показатели |
Группа 1 Контроль (n = 12) |
Группа 2 ГПТ (n = 6) |
|
Лейкоциты, ∙109/л |
8,59 ± 0,78 |
6,84 ± 1,09 * |
|
Эозинофилы, ∙109/л |
0,21 ± 0,04 |
0,17 ± 0,03 |
|
Базофилы, ∙109/л |
0,01 ± 0,01 |
0,02 ± 0,02 |
|
Нейтрофилы п/ядерные, ∙109/л |
0,29 ± 0,06 |
0,40 ± 0,06 |
|
Нейтрофилы с/ядерные, ∙109/л |
3,19 ± 0,35 |
3,24 ± 0,25 |
|
Нейтрофилы всего, ∙109/л |
3,49 ± 0,39 |
3,64 ± 0,30 |
|
Лимфоциты, ∙109/л |
4,27 ± 0,41 |
2,59 ± 0,36 * |
|
Моноциты, ∙109/л |
0,62 ± 0,12 |
0,41 ± 0,08 |
Примечание. Здесь и далее * статистически значимые (p < 0,05) различия с группой контроля.
Таблица 2
Показатели врожденного иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе (M ± m)
|
Группы Показатели |
Группа 1 Контроль (n = 12) |
Группа 2 ГПТ (n = 6) |
|
Активность фагоцитоза, % |
32,37 ± 2,01 |
29,00 ± 1,75 |
|
Интенсивность фагоцитоза, у.е. |
0,65 ± 0,05 |
0,83 ± 0,09 * |
|
Фагоцитарное число, у.е. |
2,21 ± 0,09 |
4,81 ± 0,59 * |
|
НСТ-тест спонт., активность, % |
8,67 ± 1,69 |
7,67 ± 0,49 |
|
НСТ-тест спонт., интенсивность, у.е. |
0,14 ± 0,03 |
0,26 ± 0,13 * |
|
НСТ-тест инд., активность, % |
15,05 ± 2,79 |
19,33 ± 0,61 |
|
НСТ-тест инд., интенсивность, у.е. |
0,19 ± 0,04 |
0,35 ± 0,11 * |
|
Функц. резерв (активность НСТ-теста) |
1,74 ± 0,08 |
2,52 ± 0,05 * |
|
Функц. резерв (интенсивность НСТ-теста) |
1,36 ± 0,04 |
1,35 ± 0,05 |
Полагаем, что ПТГ может оказывать как прямое, так и опосредованное влияние на иммунокомпетентные клетки и формирование иммунного статуса при гиперпаратиреозе. Рецепторы к ПТГ обнаружены на гранулоцитах и лимфоцитах периферической крови [14]. Активация фагоцитов в периферической крови при гиперпаратиреозе может быть многофакторной. В частности, связана с изменением цитокинового профиля в крови. Показано, что при гиперпаратиреозе в крови возрастает концентрация провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ТНФ-альфа [13]. На роль ключевого механизма дисфункции фагоцитов при гиперпаратиреозе претендует повышение внутриклеточной концентрации Ca2+ и сопутствующие изменения активности внутриклеточных мессенджеров (аденилатциклазы), интенсивности углеводного обмена, захвата и утилизации кислорода и др. факторы [9].
В литературе представлены сведения о депрессии гуморального и клеточного звеньев адаптивного иммунитета при гиперпаратиреозе: снижение количества Т-лимфоцитов и их субпопуляций, количества В-лимфоцитов, пролиферативной активности клеток, синтеза антител и др. ПТГ дозозависимо ингибирует пролиферацию В-лимфоцитов здоровых людей. Полагают, что данные эффекты ПТГ опосредованы повышением концентрации цАМФ и внутриклеточной концентрации кальция, а применение блокаторов кальциевых каналов, таких как нифедипин или верапамил, или паратиреоидэктомия восстанавливают функциональную активность Т- и В-лимфоцитов [12]. С учетом факта о том, что кальций может активировать фосфолипазу А2 и деградацию мембранных фосфолипидов, участвовать в изменении редокс-статуса клетки и, как следствие, приводить к инициации гибели лимфоцитов путем некроза/апоптоза, изменению функциональной активности клеток, нами исследована концентрация продуктов ПОЛ в лимфоцитах при экспериментальном гиперпаратиреозе. Результаты представлены в табл. 4.
Таблица 3
Показатели адаптивного иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе (M ± m)
|
Группы Показатели |
Группа 1 Контроль (n = 12) |
Группа 2 ГПТ (n = 6) |
|
ГЗТ |
0,36 ± 0,03 |
0,27 ± 0,05 * |
|
ЯСК, ∙106 ЯСК |
192,2 ± 24,7 |
137,40 ± 321,39 * |
|
ЯСК, ∙104 |
125,3 ± 33,5 |
57,90 ± 13,71 * |
Таблица 4
Содержание продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов периферической крови при экспериментальном гиперпаратиреозе
|
Показатели |
Группа 1 Контроль (n = 12) |
Группа 2 ГПТ (n = 6) |
|
Е220 (г), у.е./мл |
0,57 ± 0,11 |
0,78 ± 0,23 * |
|
Е232 (г), у.е./мл |
0,18 ± 0,07 |
0,37 ± 0,08 * |
|
Е278 (г), у.е./мл |
0,011 ± 0,005 |
0,079 ± 0,015 * |
|
Е400 (г), у.е./мл |
0,012 ± 0,005 |
0,044 ± 0,013 |
|
ДК (г), е.и.о. |
0,18 ± 0,04 |
0,64 ± 0,13 * |
|
КД и СТ (г), е.и.о. |
0,013 ± 0,005 |
0,466 ± 0,248 * |
|
ШО (г), е.и.о. |
0,047 ± 0,017 |
0,326 ± 0,182 |
|
Е220 (и), у.е./мл |
2,65 ± 0,17 |
5,42 ± 0,49 * |
|
Е232 (и), у.е./мл |
0,72 ± 0,11 |
5,71 ± 0,78 * |
|
Е278 (и), у.е./мл |
0,54 ± 0,04 |
0,74 ± 0,06 * |
|
Е400 (и), у.е./мл |
0,041 ± 0,009 |
0,156 ± 0,044 |
|
ДК (и), е.и.о. |
0,25 ± 0,03 |
0,99 ± 0,06 * |
|
КД и СТ (и), е.и.о. |
0,204 ± 0,011 |
0,228 ± 0,019 |
|
ШО (и), е.и.о. |
0,017 ± 0,005 |
0,022 ± 0,008 |
Примечание. г – гептановая, и – изопропанольная фракции.
Установлено, что в гептановой фракции липидного экстракта лимфоцитов периферической крови, которая аккумулирует большую часть резервных липидов (триацилглицеридов), возрастает абсолютное содержание общих липидов, диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов. Пересчет показателей на единицы индексов окисления выявил повышение относительного содержания диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов, т.е. соответственно первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Последний подход, отражающий уровень продуктов ПОЛ относительно ненасыщенных жирнокислотных ацилов, позволяет предотвратить ошибку завышения, обусловленную частичным перекрыванием «пиков» поглощения изолированных двойных связей и диеновых конъюгатов [1]. В изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов, концентрирующей основное количество мембранных фосфолипидов, увеличивается абсолютное содержание общих липидов, диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов, в единицах индексов окисления увеличивается только количество диеновых конъюгатов – первичных и вторичных продуктов ПОЛ.
С использованием методов корреляционного анализа установлено, что интенсивность реакции ГЗТ и абсолютное количество АОК в селезенке крыс снижаются по мере увеличения относительного количества первичных продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов) в изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов (R = −0,62; p < 0,05; R = −0,77; p < 0,05 соответственно). Отрицательная слабая, на правах тенденции (p > 0,05) связь отмечена между показателями адаптивного иммунитета и относительным содержанием продуктов в гептановой фракции липидного экстракта лимфоцитов. Кроме того, количество лимфоцитов в периферической крови снижается по мере увеличения количества первичных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов (R = −0,54; p < 0,05) и первичных и вторичных продуктов ПОЛ в гептановой фракции липидного экстракта лимфоцитов (R = −0,47; p < 0,05; R = −0,49; p < 0,05 соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о наличии связи между интенсивностью процессов свободнорадикального окисления в лимфоцитах и их количеством в периферической крови, а также участием в реализации адаптивного иммунитета, регистрируемого по количеству АОК в селезенке и интенсивности реакции ГЗТ. Тем не менее следует учитывать, что обнаруженные с помощью корреляционного анализа связи между показателями иммунного статуса и интенсивностью процессов свободнорадикального окисления не указывают на направление причинно-следственной связи в патогенезе изменений иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе.
Выводы
1. При диета-индуцированном экспериментальном гиперпаратиреозе у крыс снижается количество лимфоцитов в периферической крови, увеличивается поглотительная способность и генерация кислородных радикалов фагоцитами периферической крови, снижается выраженность Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа.
2. В лимфоцитах периферической крови крыс с экспериментальным гиперпаратиреозом увеличивается содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ в гептановой фракции и первичных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта.
3. Установлено наличие связи между содержанием продуктов ПОЛ в липидном экстракте лимфоцитов и их количеством в периферической крови, а также выраженностью Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа.
Рецензенты:Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;
Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.
Работа поступила в редакцию 18.03.2015.