Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

РОЛЬ ПРОЦЕССОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В ПАТОГЕНЕЗЕ ИЗМЕНЕНИЙ ИММУННОГО СТАТУСА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРПАРАТИРЕОЗЕ

Осиков М.В. 1 Черепанов Д.А. 1 Гизингер О.А. 1 Федосов А.А. 1
1 ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России
Одним из факторов изменений иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе может быть активация процессов свободнорадикального окисления. Проверка гипотезы выполнена на 72 белых нелинейных крысах-самцах, разделенных на группы: 1 – интактные крысы, 2 – экспериментальный гиперпаратиреоз, который создавали содержанием животных на синтетической гиперфосфатной смеси (0,6 % кальция и 4,2 % фосфора) в течение 120 дней. В периферической крови определяли количественный состав лейкоцитов, функциональную активность фагоцитов по поглотительной способности к частицам латекса и генерации активных форм кислорода в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте. Th1- и Th2-зависимый ответ оценивали в реакции гиперчувствительности и по количеству антителообразующих клеток в селезенке крыс после иммунизации. В гептановой и изопропанольной фракциях липидного экстракта лимфоцитов крови определяли содержание первичных (диеновые конъюгаты), вторичных (кетодиены и сопряженные триены) и конечных (основания Шиффа) продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Установлено, что при диета-индуцированном экспериментальном гиперпаратиреозе у крыс снижается количество лимфоцитов в периферической крови, увеличивается поглотительная способность и генерация кислородных радикалов фагоцитами периферической крови, снижается выраженность Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа. В лимфоцитах периферической крови крыс с экспериментальным гиперпаратиреозом увеличивается содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ в гептановой фракции и первичных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта. Выраженность Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа при гиперпаратиреозе снижается по мере увеличения количества первичных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов, а количество лимфоцитов в периферической крови снижается по мере увеличения концентрации первичных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов и первичных и вторичных продуктов ПОЛ в гептановой фракции липидного экстракта лимфоцитов.
гиперпаратиреоз
врожденный и адаптивный иммунитет
свободнорадикальное окисление
перекисное окисление липидов
1. Волчегорский И.А. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма / И.А. Волчегорский, И.И. Долгушин, О.Л. Колесников и др. – Челябинск: Изд-во ЧелГПУ, 2000. – 167 с.
2. Осиков М.В. Влияние гемодиализа на процессы свободно-радикального окисления у больных хронической почечной недостаточностью / М.В. Осиков, В.Ю. Ахматов, Л.В. Кривохижина // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. – 2007. – № 16 (71). – С. 95–97.
3. Осиков М.В. Влияние альфа1-кислого гликопротеина на процессы свободнорадикального окисления при экспериментальной печеночной недостаточности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 7. – С. 29–31.
4. Осиков М.В. Гемостазиологические эффекты альфа-1-кислого гликопротеина при экспериментальном септическом перитоните / М.В. Осиков, Е.В. Макаров, Л.В. Кривохижина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 8. – С. 143–145.
5. Осиков М.В. Роль орозомукоида в регуляции активности систем плазменного протеолиза при экспериментальной почечной недостаточности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 148, № 7. – С. 27–30.
6. Осиков М.В. Уровень эритропоэтина и иммунный статус организма у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев, А.А. Федосов // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 4; URL: www.science-education.ru/110-9973 (дата обращения: 31.01.2015).
7. Осиков М.В. Современные представления о гемостазиологических эффектах эритропоэтина / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 5–1. – С. 196–200.
8. Осиков М.В. Эритропоэтин как регулятор экспрессии тромбоцитарных гликопротеинов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 1. – URL: www.science-education.ru/107-7731 (дата обращения: 31.01.2015).
9. Alexiewicz J.M. Impaired phagocytosis in dialysis patients: studies on mechanisms / J.M. Alexiewicz, M. Smogorzewski, G.Z. Fadda et al. // American Journal of Nephrology. – 1991. – Vol. 11(2). – Р. 102–111.
10. van Ballegooijen A.J. Serum parathyroid hormone in relation to all-cause and cardiovascular mortality: the Hoorn study / A.J. van Ballegooijen, I. Reinders, M. Visser et al. // Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. – 2013. – Vol. 98. – Р. E638-E645.
11. Draper H.H. Osteoporosis in aging rats induced by high phosphorus diets / H.H. Draper, T.L. Sie, J.G. Bergan // J. Nutr. – 1972. – Vol. 102(9). – Р. 1133–1141.
12. Geara, A.S. Effects of parathyroid hormone on immune function / A.S. Geara, M.R. Castellanos, C. Bassil et al. // Clin Dev Immunol. – 2010. – doi: 10.1155/2010/418695. – URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20886005 (дата обращения: 31.01.2015).
13. Emam A.A. Inflammatory biomarkers in patients with asymptomatic primary hyperparathyroidism / A.A. Emam, S.G. Mousa, K.Y. Ahmed et al. // Medical Principles and Practice. – 2012. – Vol. 21(3). – Р. 249–253.
14. Seeliger S. The parathyroid hormone-2 receptor is expressed on human leukocytes and down-regulated in hyperparathyroidism / S. Seeliger, M. Hausberg, I. Eueet et al. // Clin Nephrol. – 2003. – Vol. 59(6). – Р. 429–435.

Изучение механизмов регуляции гомеостаза является актуальной проблемой современной фундаментальной медицинской науки и предпосылкой для создания средств патогенетической коррекции при различной патологии [2–5]. Ранее нами убедительно продемонстрировано участие эритропоэтина в регуляции гомеостаза при хронической почечной недостаточности (ХПН) в клинических и экспериментальных условиях [6–8]. Одним из неблагоприятных последствий и причиной гнойно-септических осложнений при ХПН является развитие вторичного иммунодефицита, патогенез которого является многофакторным и до конца не изученным. На роль одного из патогенетических факторов претендует вторичный гиперпаратиреоз, и связанные с ним изменения гомеостаза кальция и фосфора могут оказывать влияние на состояние иммуноцитов, регуляцию иммунного ответа. Гиперпаратиреоз и высокие концентрации ПТГ в крови связывают с повышенным риском смертности, в том числе из-за активации эффекторов врожденного иммунитета, эскалации системного воспаления, атеросклероза и кардиоваскулярной патологии, а также депрессии адаптивного иммунитета, приводящей к инфекционным осложнениям [10]. Патогенез изменений иммунного статуса при гиперпаратиреозе до конца не ясен, сведения по этому вопросу крайне противоречивы. Цель работы – исследовать роль процессов свободнорадикального окисления в лимфоцитах периферической крови в патогенезе изменений иммунного статуса при экспериментальном гиперпаратиреозе.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на 72 белых нелинейных крысах-самцах массой 200–220 г, находящихся в стандартных условиях вивария. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись при строгом соблюдении требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента с последующей утилизацией. В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. Гиперпаратиреоз у крыс моделировали содержанием на гиперфосфатной диете по методу H.H. Draper et al. [11] в нашей модификации. В течение 120 дней рацион крыс состоял из синтетической гиперфосфатной смеси (0,6 % кальция и 4,2 % фосфора). Развитие гиперпаратиреоза верифицировали по увеличению концентрации ПТГ в плазме. Кровь для исследований через 120 дней забирали пункцией левого желудочка сердца. В периферической крови общепринятыми методами определяли общее количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу. Поглотительную способность фагоцитов исследовали с частицами монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистирольного латекса, учитывали активность, интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число. Генерацию активных форм кислорода оценивали в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте с учетом активности (% клеток) и интенсивности (у.е.) и расчетом функционального резерва клеток. Оценку гуморального Th2-зависимого иммунного ответа у крыс проводили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, оценку клеточного Th1-зависимого иммунного ответа – по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами. Уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в лимфоцитах определяли спектрофотометрически с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта [1]. Результаты выражали ‒ у.е./мл исследуемой пробы и в единицах индексов окисления (е.и.о.) – Е232/Е220 (относительное содержание диеновых конъюгатов – ДК, первичных продуктов ПОЛ), Е278/Е220 (уровень кетодиенов и сопряженных триенов – КД и СТ, вторичных продуктов ПОЛ) и Е400/Е220 (уровень оснований Шиффа – ШО, конечных продуктов ПОЛ). Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 8.0. Для оценки различий между группами применяли критерии Манна – Уитни, Краскела – Уоллиса, Вальда – Вольфовица, для установления связей между показателями – коэффициент корреляции Спирмена, различия считали значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что при экспериментальном гиперпаратиреозе в периферической крови снижается количество лейкоцитов, абсолютное количество лимфоцитов (табл. 1). Общее количество лейкоцитов не выходит за пределы допустимых референсных значений. Отмечено усиление функциональной активности фагоцитов в периферической крови по способности клеток захватывать частицы латекса и генерации ими активных форм кислорода (табл. 2). Интенсивность фагоцитоза возрастает на 28 %, фагоцитарное число – на 118 %, интенсивность спонтанного НСТ-теста – на 86 %, интенсивность индуцированного НСТ-теста – на 84 %. На 45 % возрастает функциональный резерв фагоцитов в крови, оцениваемый по активности НСТ-теста. Показатели адаптивного иммунитета у крыс при экспериментальном гиперпаратиреозе представлены в табл. 3. Интенсивность реакции ГЗТ, косвенно отражающая интенсивность Th1-зависимого иммунного ответа, снижается на 25 %. Количество антителообразующих клеток в селезенке снижается как в абсолютных величинах (на 54 %), так и в пересчете на 106 ядросодержащих клеток (ЯСК) (на 29 %), что демонстрирует угнетение Th2-зависимого иммунного ответа. Полагаем, что депрессия показателей адаптивного иммунитета в определенной мере обусловлена лимфоцитопенией. При проведении корреляционного анализа нами установлена прямая средней силы статистически значимая связь между количеством лимфоцитов в периферической крови и абсолютным количеством АОК в селезенке (коэффициент корреляции Спирмена R = 0,62; p < 0,05).

Таблица 1

Количественный состав лейкоцитов в периферической крови при экспериментальном гиперпаратиреозе (M ± m)

Группы

Показатели

Группа 1

Контроль (n = 12)

Группа 2

ГПТ (n = 6)

Лейкоциты, ∙109/л

8,59 ± 0,78

6,84 ± 1,09 *

Эозинофилы, ∙109/л

0,21 ± 0,04

0,17 ± 0,03

Базофилы, ∙109/л

0,01 ± 0,01

0,02 ± 0,02

Нейтрофилы п/ядерные, ∙109/л

0,29 ± 0,06

0,40 ± 0,06

Нейтрофилы с/ядерные, ∙109/л

3,19 ± 0,35

3,24 ± 0,25

Нейтрофилы всего, ∙109/л

3,49 ± 0,39

3,64 ± 0,30

Лимфоциты, ∙109/л

4,27 ± 0,41

2,59 ± 0,36 *

Моноциты, ∙109/л

0,62 ± 0,12

0,41 ± 0,08

Примечание. Здесь и далее * статистически значимые (p < 0,05) различия с группой контроля.

Таблица 2

Показатели врожденного иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе (M ± m)

Группы

Показатели

Группа 1

Контроль (n = 12)

Группа 2

ГПТ (n = 6)

Активность фагоцитоза, %

32,37 ± 2,01

29,00 ± 1,75

Интенсивность фагоцитоза, у.е.

0,65 ± 0,05

0,83 ± 0,09 *

Фагоцитарное число, у.е.

2,21 ± 0,09

4,81 ± 0,59 *

НСТ-тест спонт., активность, %

8,67 ± 1,69

7,67 ± 0,49

НСТ-тест спонт., интенсивность, у.е.

0,14 ± 0,03

0,26 ± 0,13 *

НСТ-тест инд., активность, %

15,05 ± 2,79

19,33 ± 0,61

НСТ-тест инд., интенсивность, у.е.

0,19 ± 0,04

0,35 ± 0,11 *

Функц. резерв (активность НСТ-теста)

1,74 ± 0,08

2,52 ± 0,05 *

Функц. резерв (интенсивность НСТ-теста)

1,36 ± 0,04

1,35 ± 0,05

Полагаем, что ПТГ может оказывать как прямое, так и опосредованное влияние на иммунокомпетентные клетки и формирование иммунного статуса при гиперпаратиреозе. Рецепторы к ПТГ обнаружены на гранулоцитах и лимфоцитах периферической крови [14]. Активация фагоцитов в периферической крови при гиперпаратиреозе может быть многофакторной. В частности, связана с изменением цитокинового профиля в крови. Показано, что при гиперпаратиреозе в крови возрастает концентрация провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ТНФ-альфа [13]. На роль ключевого механизма дисфункции фагоцитов при гиперпаратиреозе претендует повышение внутриклеточной концентрации Ca2+ и сопутствующие изменения активности внутриклеточных мессенджеров (аденилатциклазы), интенсивности углеводного обмена, захвата и утилизации кислорода и др. факторы [9].

В литературе представлены сведения о депрессии гуморального и клеточного звеньев адаптивного иммунитета при гиперпаратиреозе: снижение количества Т-лимфоцитов и их субпопуляций, количества В-лимфоцитов, пролиферативной активности клеток, синтеза антител и др. ПТГ дозозависимо ингибирует пролиферацию В-лимфоцитов здоровых людей. Полагают, что данные эффекты ПТГ опосредованы повышением концентрации цАМФ и внутриклеточной концентрации кальция, а применение блокаторов кальциевых каналов, таких как нифедипин или верапамил, или паратиреоидэктомия восстанавливают функциональную активность Т- и В-лимфоцитов [12]. С учетом факта о том, что кальций может активировать фосфолипазу А2 и деградацию мембранных фосфолипидов, участвовать в изменении редокс-статуса клетки и, как следствие, приводить к инициации гибели лимфоцитов путем некроза/апоптоза, изменению функциональной активности клеток, нами исследована концентрация продуктов ПОЛ в лимфоцитах при экспериментальном гиперпаратиреозе. Результаты представлены в табл. 4.

Таблица 3

Показатели адаптивного иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе (M ± m)

Группы

Показатели

Группа 1

Контроль (n = 12)

Группа 2

ГПТ (n = 6)

ГЗТ

0,36 ± 0,03

0,27 ± 0,05 *

ЯСК, ∙106 ЯСК

192,2 ± 24,7

137,40 ± 321,39 *

ЯСК, ∙104

125,3 ± 33,5

57,90 ± 13,71 *

Таблица 4

Содержание продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов периферической крови при экспериментальном гиперпаратиреозе

Показатели

Группа 1

Контроль (n = 12)

Группа 2

ГПТ (n = 6)

Е220 (г), у.е./мл

0,57 ± 0,11

0,78 ± 0,23 *

Е232 (г), у.е./мл

0,18 ± 0,07

0,37 ± 0,08 *

Е278 (г), у.е./мл

0,011 ± 0,005

0,079 ± 0,015 *

Е400 (г), у.е./мл

0,012 ± 0,005

0,044 ± 0,013

ДК (г), е.и.о.

0,18 ± 0,04

0,64 ± 0,13 *

КД и СТ (г), е.и.о.

0,013 ± 0,005

0,466 ± 0,248 *

ШО (г), е.и.о.

0,047 ± 0,017

0,326 ± 0,182

Е220 (и), у.е./мл

2,65 ± 0,17

5,42 ± 0,49 *

Е232 (и), у.е./мл

0,72 ± 0,11

5,71 ± 0,78 *

Е278 (и), у.е./мл

0,54 ± 0,04

0,74 ± 0,06 *

Е400 (и), у.е./мл

0,041 ± 0,009

0,156 ± 0,044

ДК (и), е.и.о.

0,25 ± 0,03

0,99 ± 0,06 *

КД и СТ (и), е.и.о.

0,204 ± 0,011

0,228 ± 0,019

ШО (и), е.и.о.

0,017 ± 0,005

0,022 ± 0,008

Примечание. г – гептановая, и – изопропанольная фракции.

Установлено, что в гептановой фракции липидного экстракта лимфоцитов периферической крови, которая аккумулирует большую часть резервных липидов (триацилглицеридов), возрастает абсолютное содержание общих липидов, диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов. Пересчет показателей на единицы индексов окисления выявил повышение относительного содержания диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов, т.е. соответственно первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Последний подход, отражающий уровень продуктов ПОЛ относительно ненасыщенных жирнокислотных ацилов, позволяет предотвратить ошибку завышения, обусловленную частичным перекрыванием «пиков» поглощения изолированных двойных связей и диеновых конъюгатов [1]. В изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов, концентрирующей основное количество мембранных фосфолипидов, увеличивается абсолютное содержание общих липидов, диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов, в единицах индексов окисления увеличивается только количество диеновых конъюгатов – первичных и вторичных продуктов ПОЛ.

С использованием методов корреляционного анализа установлено, что интенсивность реакции ГЗТ и абсолютное количество АОК в селезенке крыс снижаются по мере увеличения относительного количества первичных продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов) в изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов (R = −0,62; p < 0,05; R = −0,77; p < 0,05 соответственно). Отрицательная слабая, на правах тенденции (p > 0,05) связь отмечена между показателями адаптивного иммунитета и относительным содержанием продуктов в гептановой фракции липидного экстракта лимфоцитов. Кроме того, количество лимфоцитов в периферической крови снижается по мере увеличения количества первичных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов (R = −0,54; p < 0,05) и первичных и вторичных продуктов ПОЛ в гептановой фракции липидного экстракта лимфоцитов (R = −0,47; p < 0,05; R = −0,49; p < 0,05 соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о наличии связи между интенсивностью процессов свободнорадикального окисления в лимфоцитах и их количеством в периферической крови, а также участием в реализации адаптивного иммунитета, регистрируемого по количеству АОК в селезенке и интенсивности реакции ГЗТ. Тем не менее следует учитывать, что обнаруженные с помощью корреляционного анализа связи между показателями иммунного статуса и интенсивностью процессов свободнорадикального окисления не указывают на направление причинно-следственной связи в патогенезе изменений иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе.

Выводы

1. При диета-индуцированном экспериментальном гиперпаратиреозе у крыс снижается количество лимфоцитов в периферической крови, увеличивается поглотительная способность и генерация кислородных радикалов фагоцитами периферической крови, снижается выраженность Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа.

2. В лимфоцитах периферической крови крыс с экспериментальным гиперпаратиреозом увеличивается содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ в гептановой фракции и первичных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта.

3. Установлено наличие связи между содержанием продуктов ПОЛ в липидном экстракте лимфоцитов и их количеством в периферической крови, а также выраженностью Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа.

Рецензенты:

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;

Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.

Работа поступила в редакцию 18.03.2015.


Библиографическая ссылка

Осиков М.В., Черепанов Д.А., Гизингер О.А., Федосов А.А. РОЛЬ ПРОЦЕССОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В ПАТОГЕНЕЗЕ ИЗМЕНЕНИЙ ИММУННОГО СТАТУСА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРПАРАТИРЕОЗЕ // Фундаментальные исследования. – 2015. – № 1-3. – С. 563-568;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=37061 (дата обращения: 07.12.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074