Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749


Kovalevskaya N.P. 1
1 Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms
Structural and functional genomic analysis of pathogenic bacteria demonstrated that the evolution of antibiotic-resistant profiles of clinical isolates was associated with the distribution of integrating conjugative elements. Those mobile genetic elements were able not just transfer the antibiotic-resistance genes, but also mobilize the non-conjugative plasmids and genomic islets in trans, while providing the alternative mechanisms for horizontal transfer of antibiotic-resistant genes. Recently identified mosaic genes of tetracycline resistance supported the notion that the conjugative transposons form modules that in case of homologous recombination were able to exchange by modules with other mobile genetic elements. The formation of new class of antibiotic resistance hybrid genes occurred at the expense of recombination of the portions of similar genes from different conjugative transposons. The analysis of the distribution dynamics of resistance genes to tetracycline, vancomycin and macrolide antibiotics among the pathogenic bacteria in recent decades in different countries allowed revealing the transfer of antibiotic resistance determinants among the phylogenetically distant bacterial groups.
bacterial genome
antibiotic resistance
horizontal gene transfer
1. Agersø Y, Pedersen AG, Aarestrup FM (2006) Identification of Tn5397-like and Tn916-like transposons and diversity of the tetracycline resistance gene tet(M) in enterococci from humans, pigs and poultry. J Antimicrob Chemother 57: 832–839.
2. Arthur M, Molinas C, Depardieu F, Courvalin P (1993) Characterization of Tn1546, a Tn3-related transposon conferring glycopeptide resistance by synthesis of depsipeptide peptidoglycan precursors in Enterococcus faecium BM4147. J Bacteriol 175:117–127.
3. Arzese AR, Tomasetig L, Botta GA (2000) Detection of tetQ and ermF antibiotic resistance genes in Prevotella and Porphyromonas isolates from clinical specimens and resident microbiota of humans. J Antimicrob Chemother 45: 577–582.
4. Bi D, Xu Z, Harrison E et al. (2012) ICEberg: a web-based resource for integrative and conjugative elements found in Bacteria. Nucl Acids Res 40: D621-D626.
5. Bourdon N, Fines-Guyon M, Thiolet JM et al. (2011) Changing trends in vancomycin-resistant enterococci in French hospitals, 2001–08. J Antimicrob Chemother 66: 713–721.
6. Calatayud L, Ardanuy C, Tubau F et al. (2010) Serotype and genotype replacement among macrolide-resistant invasive Pneumococci in adults: mechanisms of resistance and association with different transposons. J Clin Microbiol 48: 1310–1316.
7. Croucher NJ, Harris SR, Fraser C et al. (2011) Rapid pneumococcal evolution in response to clinical interventions. Science 331: 430–434.
8. Dahl KH, Simonsen GS, Olsvik O, Sundsfjord A. (1999) Heterogeneity in the vanB gene cluster of genomically diverse clinical strains of vancomycin-resistant enterococci. Antimicrob Agents Chemother 43: 1105–1110.
9. De Vries LE, Christensen H, Skov RL et al. (2009) Diversity of the tetracycline resistance gene tet(M) and identification of Tn916- and Tn5801-like (Tn6014) transposons in Staphylococcus aureus from humans and animals. J Antimicrob Chemother 64: 490–500.
10. Del Grosso M, Camilli R, Barbabella G et al. (2011) Genetic resistance elements carrying mef subclasses other than mef(A) in Streptococcus pyogenes. Antimicrob Agents Chemother 55: 3226–3230.
11. Ding F, Tang P, Hsu M-H et al. (2009) Genome evolution driven by host adaptations results in a more virulent and antimicrobial-resistant Streptococcus pneumoniae serotype 14. BMC Genomics 10: 158.
12. Evers S, Courvalin P (1996) Regulation of VanB-type vancomycin resistance gene expression by the VanS(B)-VanR(B) two-component regulatory system in Enterococcus faecalis V583. J Bacteriol 178: 1302–1309.
13. Gold HS, Unal S, Cercenado E et al. (1993) A gene conferring resistance to vancomycin but not teicoplanin in isolates of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium demonstrates homology with vanB, vanA, and vanC genes of enterococci. Antimicrob Agents Chemother 37: 1604–1609.
14. Hughes VM, Datta N (1983) Conjugative plasmids in bacteria of the ‘pre-antibiotic’ era. Nature 302: 725–726.
15. Huys G, D’Haene K, Collard J-M, Swings J (2004) Prevalence and molecular characterization of tetracycline resistance in Enterococcus isolates from food. Appl Environ Microbiol 70: 1555–1562.
16. Jasni AS, Mullany P, Hussain H, Roberts AP (2010) Demonstration of conjugative transposon (Tn5397)-mediated horizontal gene transfer between Clostridium difficile and Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother 54: 4924–4926.
17. Kazimierczak KA, Rincon MT, Patterson AJ et al. (2008) A new tetracycline efflux gene, tet(40), is located in tandem with tet(O/32/O), in a human gut firmicute bacterium and in metagenomic library clones. Antimicrob Agents Chemother 52: 4001–4009.
18. Li XZ, Nikaido H (2010) Efflux-mediated drug resistance in bacteria an update. Drugs 69: 1555–1623.
19. Mingoia M, Tili E, Manso E et al. (2011) Heterogeneity of Tn5253-like composite elements in clinical Streptococcus pneumoniae isolates. Antimicrob Agents Chemother 55: 1453–1459.
20. Mingoia M, Morici E, Brenciani A. et al. (2014) Genetic basis of the association of resistance genes mef(I) (macrolides) and catQ (chloramphenicol) in streptococci. Front Microbiol 5: 747.
21. Nguyen M, Vedantam G (2011) Mobile genetic elements in the genus Bacteroides, and their mechanism(s) of dissemination. Mobile genetic elements 1: 187–196.
22. Nikolich MP, Shoemaker NB, Salyers AA (1992) A Bacteroides tetracycline resistance gene represents a new class of ribosome protection tetracycline resistance. Antimicrob Agents Chemother 36: 1005–1012.
23. Patel R, Uhl JR, Kohner P et al. (1998) DNA sequence variation within vanA, vanB, vanC-1, and vanC-2/3 genes of clinical Enterococcus isolates. Antimicrob Agents Chemother 42: 202–205.
24. Quintiliani RJr, Courvalin P (1996) Characterization of Tn1547, a composite transposon flanked by the IS16 and IS256-like elements, that confers vancomycin resistance in Enterococcus faecalis BM4281. Gene 172: 1–8.
25. Roberts AP, Johanesen PA, Lyras D et al. (2001) Comparison of Tn5397 from Clostridium difficile, Tn916 from Enterococcus faecalis and the CW459tet(M) element from Clostridium perfringens shows that they have similar conjugation regions but different insertion and excision modules. Microbiology 147: 1243–1251.
26. Roberts AP, Chandler M, Courvalin P et al. (2008) Revised nomenclature for transposable genetic elements. Plasmid 60: 167–173.
27. Roberts MC, Sutcliffe J, Courvalin P et al. (1999) Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother 43: 2823–2830.
28. Schwarz FV, Perreten V, Teuber M (2001) Sequence of the 50-kb conjugative multiresistance plasmid pRE25 from Enterococcus faecalis. Plasmid 46: 170–187.
29. Shaw JH, Clewell DB (1985) Complete nucleotide sequence of macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance transposon Tn917 in Streptococcus faecalis . J Bacteriol 164: 782–796.
30. Shoemaker NB, Vlamakis H, Hayes K, Salyers AA (2001) Evidence for extensive resistance gene transfer among Bacteroides spp. and among Bacteroides and other genera in the human colon. Appl Environ Microbiol 67: 561–568.
31. Su YA, He P, Clewell DB (1992) Characterization of the tet(M) determinant of Tn916: evidence for regulation by transcription attenuation. Antimicrob Agents Chemother 36: 769–778.
32. Trieu-Cuot P, Poyart-Salmeron C, Carlier C, Courvalin P (1990) Nucleotide sequence of the erythromycin resistance gene of the conjugative transposon Tn1545. Nucl Acids Res 18: 3660.
33. Tsvetkova K, Marvaud J-C, Lambert T (2010) Analysis of the mobilization functions of the vancomycin resistance transposon Tn1549, a member of a new family of conjugative elements. J Bacteriol 192: 702–713.
34. Wang Y, Rotman ER, Shoemaker NB, Salyers AA (2005) Translational control of tetracycline resistance and conjugation in the Bacteroides conjugative transposon CTnDOT. J Bacteriol 187: 2673–2680.
35. Varaldo PE, Montanari MP, Giovanetti E (2009) Genetic elements responsible for erythromycin resistance in streptococci. Antimicrob Agents Chemother 53: 343–353.

В последние годы все больше стало появляться данных, свидетельствующих о том, что решающее воздействие на эволюцию антибиотикорезистентности патогенных бактерий оказывают конъюгативные транспозоны и SXT элементы, которые в начале 21 века были объединены в большой класс интегративных конъюгативных элементов (Integrative Conjugative Element – ICE) [26]. ICE не являются самостоятельными репликонами, но способны, подобно профагам, размещаться в хромосоме, вырезаться из нее, а главное, переноситься в другие клетки через систему конъюгации. Кроме собственного переноса, ICE способны мобилизовать неконъюгативные плазмиды и геномные острова in trans, обеспечивая альтернативные механизмы для горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности [21]. Возможность переноса детерминант антибиотикорезистентности среди филогенетически отдаленных бактерий природной микробиоты человека и животных была выявлена разными группами исследователей. Для грамотрицательных анаэробных бактерий в лабораторных условиях было показано, что транспозоны TcrEmr12256 и TcrEmr7853 могут переносить гены резистентности к тетрациклину и эритромицину между Bacteroides и Prevotella [3]. Гены tetM, tetW, ermB и ermG довольно часто обнаруживают у Firmicutes, а гены tetQ и ermF у Bacteroidetes. Среди Bacteroides гены резистентности к эритромицину ermB и ermG переносятся конъюгативными транспозонами CTnBST и TcrEmr 7853 или CTnGERM1, соответственно. Последовательности ДНК генов ermG, обнаруженные в клинических изолятах Bacteroides, на 99 % идентичны последовательностям ДНК гена Bacillus sphaericus [21]. Установлено, что перенос гена tetM между клиническими изолятами Clostridium difficile и Enterococcus spp. и похожий перенос от Clostridium difficile 630 к бактериям Bacillus subtilis и Enterococcus faecalis осуществлялся посредством конъюгативного транспозона Tn5397 [16]. Анализ современной литературы, посвященной структурно-функциональной организации ICE позволил в данном обзоре обобщить в справочной форме сведения о роли конъюгативных транспозонов в возникновении мозаичной структуры геномов современных видов и штаммов бактерий – возбудителей инфекций с множественной лекарственной устойчивостью.

В начале 1950-х годов большинство комменсальных и патогенных бактерий были восприимчивы к тетрациклину, только 2 % бактерий из коллекции Enterobacteriaceae, собранной между 1917 и 1954 годами, были устойчивы к этому антибиотику [14]. В настоящий момент известно более 40 генов резистентности к тетрациклину и обычно они ассоциируются с мобильными генетическими элементами. В бактериях резистентность к тетрациклину опосредуется преимущественно через два механизма: рибосомальную защиту (гены otrA, tetB(P), tetM, tetO, tetQ, tetS, tetT, tetW) и эффлюкс-систему (гены otrB, otrC, tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetG, tetH, tetJ, tetK, tetL, tetV, tetY, tetZ). Эффлюкс гены грамотрицательных бактерий часто ассоциируются с конъюгативными плазмидами, в то время как в грамположительных бактериях эффлюкс гены часто обнаруживают на небольших мобилизуемых плазмидах или хромосоме. Недавно описаны мозаичные тетрациклин-резистентные гены (tet(O/W), tet(O/W/O), tet(O/32/O), tet(O/W/32/O), tet(O/W/32/O/W/O)), в которых части гена резистентности к тетрациклину (Tcr) получены при рекомбинации двух или более различных классов генов [17]. Конъюгативные транспозоны (Tn, CTn) являются основным источником распространения тетрациклинрезистентных генов: tetM – Tn916, Tn5253, Tn5397, Tn5801, Tn6003, Tn2010, Tn6086, Tn6087; tetO – Tn5252; tetS – Tn6000, Tn916S; tetQ – CTnDOT, CTn7853, CTn341; tetW – TnB1230 [4]. Ранее было установлено, что аминокислотная последовательность белка TetQ лишь на 40 % идентична TetM или TetO, сходство последовательностей которых превышает 75 % [22]. Недавно проведенный филогенетический анализ гена tetM у стафилококков позволил выделить три группы конъюгативных транспозонов, ассоциированных с tetM: группа I – Tn5397; группа II – Tn916 и Tn5801; группа III Tn1545, Tn2009 и Tn5251 [9]. Мозаичные структуры гена tetM, полученные в результате рекомбинации tetM разных групп, были описаны в ряде работ [1, 15]. Обнаружение tetS в позициях, соответствующих tetM в Tn916-подобных элементах широкого круга бактерий подтверждает предположение о том, что конъюгативные транспозоны формируют модули, которые при гомологичной рекомбинации способны к обмену с модулями других элементов [25].

Гены, отвечающие за резистентность к тетрациклину регулируются разными путями [34]. Например, экспрессия гена tetM происходит под контролем механизма аттенюации транскрипции [31]. Транскрипция гена tetQ является конститутивной, тогда как трансляция генов оперона tetQ-rteA-rteB усиливается при действии тетрациклина. Увеличение продукции белка обусловлено механизмом трансляционной аттенюации. Регуляторные белки RteA и RteB конъюгативных транспозонов CTnDOT формируют двухкомпонентную регуляторную систему, которая принимает участие в переносе мобилизуемых интегративных элементов с антибиотикорезистентными детерминантами, таких как NBU1, NBU2, NBU3 (NBU – nonreplicating Bacteroides unit), транспозонов Tn4399, Tn4555, Tn4551 и плазмид pIP417, pIP419, pLV22a, pBFTM10 [21]. Коперенос различных структур, как и собственный перенос, стимулируется в 1000-10000 раз тетрациклином. Способность мобилизовать другие элементы и антибиотико-стимулирующий перенос могут объяснить 80 % резистентность к тетрациклину и высокую частоту других антибиотикорезистентных генов в Bacteroides [30].

За последние два десятилетия в разных географических зонах был отмечен уровень роста резистентности к макролидным антибиотикам среди клинических изолятов стрептококков. Около 40 генов устойчивости к эритромицину (ermr) из патогенных бактерий были выделены в 21 класс [27]. У стрептококков высокий уровень резистентности к макролидам, линкозамидам и стрептограмину B (MLS фенотип бактерий) обеспечивают гены ermA и ermB, которые кодируют метилтрансферазы, модифицирующие пострансляционно 23S рРНК. Низкая резистентность бактерий (4–16 г/л) к 14- и 15-членным макролидным антибиотикам (М фенотип бактерий) обеспечивается за счет эффлюкса антибиотиков, который контролируется генами mef и mel и индуцируется невысокими концентрациями эритромицина [18]. Гены mef-класса включают несколько вариантов [20]. Ген mefA (GenBank U70055) из Streptococcus pyogenes был описан в 1996 году, а позднее был идентифицирован ген mefE (GenBank U83667) в Streptococcus pneumoniae. Менее распространенные гены mef были обнаружены в S. pneumoniae – mefI и в S. pyogenes – mefO , а также новые аллели mefB и mefG были описаны в группе B и группе G b-гемолитических стрептококков соответственно. Идентичность генов mefA и mefE составляет 90 %. Однако эти два подкласса mef генов переносятся на различных генетических элементах: mefA на дефектном неконъюгативном транспозоне Tn1207.1, mefE на элементе mega (macrolide efflux genetic assembly) [10]. Tn1207.1 (7,244 п.н.) содержит 8 orf (open reading frame – открытая рамка считывания), одна из которых кодирует сайт-специфическую рекомбиназу. mega элемент (5532 п.н.) содержит 5 orf, но не имеет районов, кодирующих транспозазу или рекомбиназу. Отмечено, что рядом с генами mef находится orf, именуемая orf5 в Tn1207.1 и mel в mega элементе, которая имеет 56 % гомологию с геном msrA из Staphylococcus aureus, кодирующая белок суперсемейства ABC транспортеров, вовлеченный в эффлюкс макролидов. В обоих мобильных элементах mel- подобные гомологи, ассоциированные с генами mefA и mefE имеют до 98 % идентичности. В S. pneumoniae mega элемент может встраиваться в различные сайты на хромосоме или Tn916- подобные генетические элементы, которые формируют новые сложные конъюгативные транспозоны, такие как Tn2009, Tn2010, Tn2017 [4]. Tn1207.1 был обнаружен в S. pneumoniae встроенным вовнутрь гена celB, а в S. pyogenes Tn1207.1 был идентифицирован как интегрированный в конъюгативный транспозон Tn1207.3 или в профаг на хромосоме. Ген mefI в S. pneumoniae переносится сложным генетическим элементом, названным 5216IQ комплексом (30505 п.н.), состоящим из двух частей. Левая часть (15316 п.н.) формируется из фрагментов известных конъюгативных транспозонов Tn5252 и Tn916 и содержит ген tetM. Правая часть комплекса 5216IQ формируется IQ элементом, который содержит гены mefI и catQ (резистентность к хлорамфениколу). Гомология гена mefI с генами mefA из Tn1207.1 и mefE из mega элемента составляет 91,4 и 93,6 % соответственно.

Молекулярный анализ антибиотикоустойчивых клинических изолятов S. pneumoniae из разных стран показал, что конъюгативные транспозоны Tn1545, Tn3872, Tn5397, Tn6002, Tn6003 играют значительную роль в распространении генов ermB и tetM. Отмечено, что в Италии и Испании в изолятах S. pneumoniae чаще встречаются Tn6002 и Tn3872, а в Японии ‒ Tn917 [6]. Конъюгативный транспозон Tn1545 почти полностью идентичен плазмиде pAM77 из S. sanguinis (98 % идентичности), кодирует гены резистентности к тетрациклину tetM, эритромицину ermB и канамицину aphA-3 [32]. По сравнению с Tn1545 у транспозона Tn917 нет генов резистентности к тетрациклину и канамицину, а его последовательность идентична неконъюгативной плазмиде с множественной резистентностью pAD2 из Enterococcus faecalis DS16 [29]. Tn917 (5614 п.н.) содержит 5 orf, две из которых кодируют 2 специфических транспозиционных гена tnpR (резолваза) и tnpA (транспозаза), а также ген ermB. Tn917 может встраиваться в orf9 транспозона Tn916, при этом образуются новые сложные транспозоны, такие как Tn3872 и Tn2008 [11]. В другой группе транспозонов в Tn1545, Tn6002 и Tn6003 ген ermB встроен в orf20 транспозона Tn916. Было выявлено, что в транспозонах Tn1545 и Tn6003 в ген ermB встроен небольшой (~4,2 т.п.н) стрептотрицин-стрептомицин-канамицин резистентный кластер (aadE–sat4–aphA-3), названный MAS (Macrolide–Aminoglycoside–Streptothricin) элементом [35]. Этот генный кластер первоначально был описан как часть структуры транспозона Tn5405 из стафилококков, а позднее обнаружен у мультирезистентной плазмиды pRE25, сообщающей резистентность к 12 различным антибиотикам [28]. При секвенировании удалось выявить только одну нуклеотидную замену A → C в гене sat4 E. coli и соответственно замену аминокислоты Glu на Gly. Кроме того, был открыт еще один элемент антибиотикоустойчивости у пневмококков, названный омега (omega) элементом [7]. В клиническом изоляте S. pneumoniae 9409 (Франция, 2002) в районе orf20 транспозона Tn916 была обнаружена встроенная последовательность, состоящая из гена aphA-3, ограниченного 2 транскрипционными омега репрессорами, и гена ermB. У стрептококков был охарактеризован новый Tn5253-подобный конъюгативный транспозон Tn1311 (GenBank FN667862), который кроме генов резистентности к эритромицину и канамицину (ermB, aphA-3) содержал ген устойчивости к хлорамфениколу cat [19].

Серьезной клинической проблемой во многих странах Европы и США является увеличение от 20 до 40 % ванкомицин-резистентных клинических изолятов энтерококков за последние годы. Гликопептидная резистентность у грамположительных кокков является гетерогенной фенотипически и генотипически [8]. Среди ванкомицин-резистентных энтерококков из французской коллекции госпитальных штаммов, отобранных с 2001 по 2008 годы, большинство (94,8 %) составляли Enterococcus faecium с генами vanA или vanB [5]. Штаммы VanA-типа показывают индуцибельную резистентность к высоким концентрациям ванкомицина и умеренно высоким концентрациям тейкопланина. VanB фенотип характеризуется широким уровнем резистентности к ванкомицину и чувствительностью к тейкопланину. Генный кластер vanA локализован на транспозоне Tn1546, который часто переносится самотрансмиссибельными плазмидами. Распространение VanB-типа резистентности обычно связывают с распространением конъюгативного транспозона Tn1549, локализованного на плазмиде или хромосоме грамположительных кокков [2]. Оперон vanB содержит гены, кодирующие дегидрогеназу, лигазу и дипептидазу, и все эти белки имеют высокую гомологию последовательностей (67-76 % идентичности) с соответствующими белками vanA оперона, а vanRBSB регуляторные гены, которые кодируют 2-компонентную систему, лишь отдаленно напоминают vanRS (34 и 24 % идентичности) [12]. Анализ вариабельности гена vanB привел к идентификации трех субтипов, названных vanB1, vanB2 и vanB3 [13, 23]. Первоначально, было показано, что генный кластер vanB1 является частью сложного транспозона (64 т.п.н.), названного Tn1547, который имеет инцерционные последовательности IS16- и IS256-подобных элементов в E. faecalis BM4281 [24]. Впоследствии, было установлено, что и в E. faecium C68 предполагаемый конъюгативный транспозон (27 т.п.н.), названный Tn5382, содержит vanB2 генный кластер. Интеграция Tn5382 в хромосому E. faecium C68 проходит в районе выше гена pbp5. В E. faecalis E93/268 и E. faecium 654, конъюгативный транспозон Tn1549 (34 т.п.н.) содержащий vanB2 генный кластер переносится конъюгативными плазмидами pIP834 и pIP835. При сравнении последовательностей Tn1549 и Tn5382 была выявлена высокая гомология [33].

Интенсивная миграция населения в мировом пространстве в сочетании с активным эволюционным процессом в бактериальных геномах микрофлоры человека создает предпосылки для возникновения новых вариантов мобильных генетических элементов с блоками генов антибиотикорезистентности и их быстрого глобального распространения. Повышение уровня антибиотикорезистентности микроорганизмов создаёт сложности для борьбы с внутрибольничными инфекциями, которые, как правило, имеют комплексный характер. В связи с этим крайне востребована разработка международных программ по надзору за использованием антибиотиков в медицине и сельском хозяйстве.

Работа выполнена при финансовой поддержке комплексной программы фундаментальных исследований УрО РАН на 2015–2017 гг., подпрограмма «Молекулярная и клеточная биология», и проекта РФФИ-Урал № 07-04-96027.


Карпунина Т.И., д.б.н., профессор кафедры микробиологии и вирусологии с курсом клинической лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера», г. Пермь;

Маслов Ю.Н., д.м.н., заведующий микробиологической лабораторией ЦНИЛ ПГМУ, профессор кафедры микробиологии и вирусологии с курсом клинической лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера», г. Пермь.

Работа поступила в редакцию 02.03.2015.