Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Хромосомные аномалии и геномные перестройки являются наиболее частой формой генетической патологии, ассоциированной с умственной отсталостью и аутизмом. В последнее десятилетие наблюдается рост числа сообщений о вкладе геномных и хромосомных микроперестроек и вариаций числа копий последовательности ДНК (copy number variations – CNV) в патогенез умственной отсталости и аутизма [1, 4–10, 15]. Это, по-видимому, связано с активным внедрением технологии сканирования генома при использовании метода молекулярного кариотипирования, который может позволить оценить вариабельность генома с беспрецедентно высоким разрешением (до 1 тыс. пн и более) [2–4, 6, 10, 13, 14]. Суммирование нами полученных данных позволило выдвинуть рекомендации для выявления несбалансированных геномных перестроек, которые предлагают использовать такие методы полногеномного сканирования, как молекулярное кариотипирование, в качестве основного для генетической диагностики [2, 6, 9, 13]. Ранее показано, что в группах детей с умственной отсталостью и/или аутизмом подобные формы вариаций генома выявляются до 37 % случаев при использовании дополнительных биоинформатических методов для оценки влияния геномных перестроек на фенотип [2, 6, 14]. Последнее является особо актуальным, поскольку CNV могут как нести функциональные последствия, так и быть непатогенными [1, 3, 4, 8, 10, 13, 14].

Целью нашего исследования была оценка диагностической технологии молекулярного кариотипирования в сочетании с оригинальным биоинформатическим методом для выявления геномной патологии в группе детей с умственной отсталостью и аутизмом.

Материал и методы исследования

С помощью классических цитогенетических методов G- и С-окрашивания [11, 12] были исследованы образцы лимфоцитов периферической крови у 115 детей с умственной отсталостью, аутизмом и/или врождёнными пороками развития. Методом молекулярного кариотипирования (array CGH) были исследованы несбалансированные геномные вариации в соответствии с ранее описанными протоколами [6, 7]. Для проведения исследования методом array CGH использовалась платформа, содержащая около 2,7 млн проб. Пациенты, у которых выявлялись потери генетического материала, были также обследованы с помощью флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) [11, 12, 15]. Помимо этого, все обнаруженные вариации генома для оценки их влияния на фенотип анализировались с помощью оригинальной биоинформатической технологии, описанной в предыдущих работах [6].

Результаты исследования и их обсуждение

В работе обследовано 115 детей, средний возраст которых составлял 5 лет 3 месяца (от 9 мес. до 17 лет), вышеперечисленными методами. Цитогенетический анализ позволил выявить 8 численных и структурных аномалий хромосом, причём в пяти из них выявлены какие-либо геномные нарушения при применении метода молекулярного кариотипирования. В 22 случаях не обнаружено никаких геномных аномалий. Использованная технология сканирования генома дала возможность охарактеризовать геномные перестройки с точностью до нескольких десятков нуклеотидов, а также выявить CNV и потери гетерозиготности, которые произошли за счет делеций. Все случаи хромосомных аномалий были подтверждены методом FISH. Полученные результаты представлены в таблице.

Результаты цитогенетического (кариотипирование) и молекулярно-цитогенетического (молекулярное кариотипирование – array CGH) исследований у детей с умственной отсталостью, врожденными пороками развития и аутизмом

Комментируя таблицу, следует привести число пациентов с различными аномалиями генома: у трех пациентов выявлены цитогенетическими методами аномалии хромосом (размер более 5 млн пн); у двух пациентов – сочетание цитогенетически видимой аномалии и CNV; у двух пациентов – сочетание цитогенетически видимой аномалии, CNV и интрагенных вариаций числа копий ДНК; у одного ребёнка – сочетание цитогенетически видимой аномалии и интрагенных вариаций числа копий ДНК; у двух детей – субмикроскопические аномалии генома; у семи пациентов – сочетание субмикроскопических аномалий и CNV; у десяти детей – сочетание субмикроскопических аномалий, CNV и интрагенных вариаций числа копий ДНК; у одного пациента – сочетание субмикроскопической перестройки, CNV, интрагенных вариации числа копий ДНК и потери гетерозиготности; у одиннадцати пациентов выявили CNV; у сорока двух пациентов – сочетание CNV и интрагенных вариаций числа копий ДНК; у одного ребёнка – сочетание CNV, интрагенных вариаций числа копий ДНК и потери гетерозиготности; у семи пациентов – интрагенные вариации числа копий ДНК; у двух пациентов – сочетание интрагенных вариаций числа копий ДНК и потери гетерозиготности; у одного пациента – потеря гетерозиготности; у двадцати двух пациентов не было выявлено нарушений методом array CGH.

Полученные данные свидетельствуют о том, что использование метода высокоразрешающей CGH на биочипах (array CGH) представляет собой наиболее эффективный способ детекции геномных и хромосомных перестроек в группе детей с умственной отсталостью, аутизмом и врожденными пороками развития. Важно отметить, что цитогенетический анализ позволил выявить только делеции и дупликации, размер которых превышал 5 млн пн. Наиболее эффективным с точки зрения диагностики является метод array CGH. Это коррелирует с ранее полученными данными относительно исследований с применением полногеномного сканирования [2–4, 6, 8–10, 14]. Помимо этого, полученные данные позволили сделать вывод о том, что сочетание молекулярного кариотипирования и биоинформатических технологий обладает высокой эффективностью для выявления геномной патологии и определения молекулярных механизмов нарушения при умственной отсталости и аутизме. Следует отметить, что цитогенетические исследования являются тем не менее, необходимыми до проведения молекулярного кариотипирования.

Заключение

Анализ результатов нашего исследования показал, что для высокоэффективной диагностики следует использовать высокоразрешающий метод CGH на биочипах (array CGH), поскольку он не только увеличивает эффективность молекулярной диагностики, но и позволяет определить последовательности ДНК, вовлечённые в перестройки. Примечательно, что обнаруженные геномные перестройки были подтверждены методом флюоресцентной гибридизации in situ. Метод array CGH позволил охарактеризовать потерю генетического материала при микроделециях и микродупликациях с высокой точностью. Учитывая возможное развитие молекулярной терапии, полученная информация может послужить в скором времени основой для разработки тактики научно обоснованного лечения геномных заболеваний. Суммируя полученные данные, авторами был сделан вывод о том, что молекулярная диагностика требует использования таких инновационных молекулярно-цитогенетических технологий, как array CGH, и, несмотря на то, что технологии высокоразрешающей молекулярно-цитогенетической диагностики сравнительно недавно начали внедряться в медико-генетическую практику, за ними будущее.

Исследование выполнено за счет гранта Российского Научного Фонда (проект № 14-15-00411).

Работа поступила в редакцию 28.11.2014.