Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КАРИОТИПИРОВАНИЕ ДЕТЕЙ С УМСТВЕННОЙ ОТСТАЛОСТЬЮ И АУТИЗМОМ

Юров И.Ю. 2, 3, 1 Ворсанова С.Г. 2, 3, 4 Куринная О.С. 2, 3, 4 Зеленова М.А. 2, 3 Юров Ю.Б. 2, 3, 4
1 Российская медицинская академия последипломного образования
2 ФГБУ «Научный центр психического здоровья РАМН» Российской академии медицинских наук
3 Обособленное структурное подразделение ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» «Научно-исследовательский клинический институт педиатрии» Минздрава России
4 Московский городской психолого-педагогический университет
В настоящей работе с помощью классических цитогенетических методов G- и С-окрашивания были исследованы образцы лимфоцитов периферической крови у 115 детей с умственной отсталостью, врожденными пороками развития и аутизмом. Кроме того, в этой группе детей были исследованы несбалансированные геномные вариации с помощью молекулярного кариотипирования. Пациенты, у которых выявлялись потери генетического материала, были также обследованы с помощью флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Обнаружено 8 численных и структурных хромосомных перестроек (7 %), причём в пяти из них выявлены дополнительные геномные нарушения. Помимо этого, дальнейшие исследования с помощью оригинальной биоинформатической технологии позволили в 55 случаях (48 %) определить патогенетические процессы, связанные с вышеуказанными клиническими проявлениями. В 22 случаях (19 %) геномных аномалий обнаружено не было. В результате был сделан вывод о том, что эффективность использованной технологии в наших случаях составляет не менее 80 %. Таким образом, было продемонстрировано, что сочетание молекулярного кариотипирования и биоинформатических технологий обладает высокой эффективностью для выявления геномной патологии и определения молекулярных механизмов нарушения при умственной отсталости и аутизме. Тем не менее следует отметить, что цитогенетические исследования всё же являются необходимыми при проведении диагностики геномной патологии, даже несмотря на возможность использования методов молекулярного кариотипирования.
цитогенетические исследования
полногеномное сканирование
молекулярное кариотипирование
умственная отсталость
аутизм
1. Ворсанова С.Г., Юров И.Ю., Соловьев И.В., Юров Ю.Б. Гетерохроматиновые районы хромосом человека: клинико-биологические аспекты. – М.: Медпрактика, 2008. – 300 с.
2. Ворсанова С.Г., Юров И.Ю., Куринная О.С. и др. Геномные аномалии у детей с умственной отсталостью и аутизмом: использование технологии сравнительной геномной гибридизации на хромосомах in situ (HRCGH) и молекулярного кариотипирования на ДНК микроматрицах (array CGH) // Журнал Неврологии и Психиатрии им. С.С. Корсакова. – 2013. – № 8. – С. 46–49.
3. Юров И.Ю., Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б. Современные достижения в молекулярно-цитогенетической диагностике наследственных болезней (лекция) // Клиническая и Лабораторная Диагностика. – 2005. – № 11. – С. 21–29.
4. Edelmann L, Hirschhorn K. Clinical utility of array CGH for the detection of chromosomal imbalances associated with mental retardation and multiple congenital anomalies // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2009. – Vol. 1151. – P. 157–166.
5. Iourov IY, Yurov YB, Vorsanova SG. Mosaic X chromosome aneuploidy can help to explain the male-to-female ratio in autism // Med. Hypotheses. – 2008. – Vol. 70(№ 2). – P. 456.
6. Iourov I.Y., Vorsanova S.G., Kurinnaia O.S. et al. Molecular karyotyping by array CGH in a Russian cohort of children with intellectual disability, autism, epilepsy and congenital anomalies // Mol. Cytogenet. – 2012. – Vol. 5. – P. 46.
7. Iourov I.Y., Vorsanova S.G., Voinova V.Y., et al. Xq28 (MECP2) microdeletions are common in mutation-negative femaleswith Rett syndrome and cause mild subtypes of the disease // Mol. Cytogenet. – 2013. – Vol. 6. – P.53.
8. Park S.J., Jung E.H., Ryu R.S. et al. The clinical applicationof array CGH for the detection of chromosomal defects in 20,126 unselected newborns // Mol. Cytogenet. – 2013. – Vol. 6. – P. 21.
9. Slavotinek A.M. Novel microdeletion syndromes detected by chromosome microarrays // Hum Genet. – 2008. – Vol. 124(№ 1). – P. 1–17.
10. Spreiz A., Haberlandt E., Baumann M. et al. Chromosomal microaberrations in patients with epilepsy, intellectual disability, and congenital anomalies // Clin. Genet. – 2014. – Vol.86(№ 4). – P. 361–366.
11. Vorsanova S.G., Iourov I.Y., Beresheva A.K., Demidova I.A., Monakhov V.V., Kravets V.S., Bartseva O.B., Goyko E.A., Soloviev I.V., Yurov Y.B. Non-disjunction of chromosome 21, alphoid DNA variation, and sociogenetic features of Down syndrome // Tsitologiia i Genetika. – 2005. – Т.39(№ 6). – С. 30–36.
12. Vorsanova S.G., Yurov I.Y., Demidova I.A. et al. Variability in the heterochromatin regions of the chromosomes and chromosomal anomalies in children with autism: identification of genetic markers of autistic spectrum disorders. // Neurosci. Behav. Physiol. – 2007. – Vol. 37, № 6. – Р. 553–558.
13. Vorsanova S.G., Yurov Y.B., Soloviev I.V., Iourov I.Y. Molecular cytogenetic diagnosis and somatic genome variations // Curr. Genomics. – 2010. – Vol.11, № 6. – P. 440–446.
14. Xu F., Li L., Schulz V.P., et al. Cytogenomic mapping and bioinformatic mining reveal interacting brain expressed genes for intellectual disability // Mol. Cytogenet. – 2014. – Vol. 7. – P. 4.
15. Yurov Y.B., Vorsanova S.G., Iourov I.Y. et al. Unexplained autism is frequently associated with low-level mosaic aneuploidy. // J. Med. Genet. – 2007. – Vol. 44, № 8. – P. 521–525.

Хромосомные аномалии и геномные перестройки являются наиболее частой формой генетической патологии, ассоциированной с умственной отсталостью и аутизмом. В последнее десятилетие наблюдается рост числа сообщений о вкладе геномных и хромосомных микроперестроек и вариаций числа копий последовательности ДНК (copy number variations – CNV) в патогенез умственной отсталости и аутизма [1, 4–10, 15]. Это, по-видимому, связано с активным внедрением технологии сканирования генома при использовании метода молекулярного кариотипирования, который может позволить оценить вариабельность генома с беспрецедентно высоким разрешением (до 1 тыс. пн и более) [2–4, 6, 10, 13, 14]. Суммирование нами полученных данных позволило выдвинуть рекомендации для выявления несбалансированных геномных перестроек, которые предлагают использовать такие методы полногеномного сканирования, как молекулярное кариотипирование, в качестве основного для генетической диагностики [2, 6, 9, 13]. Ранее показано, что в группах детей с умственной отсталостью и/или аутизмом подобные формы вариаций генома выявляются до 37 % случаев при использовании дополнительных биоинформатических методов для оценки влияния геномных перестроек на фенотип [2, 6, 14]. Последнее является особо актуальным, поскольку CNV могут как нести функциональные последствия, так и быть непатогенными [1, 3, 4, 8, 10, 13, 14].

Целью нашего исследования была оценка диагностической технологии молекулярного кариотипирования в сочетании с оригинальным биоинформатическим методом для выявления геномной патологии в группе детей с умственной отсталостью и аутизмом.

Материал и методы исследования

С помощью классических цитогенетических методов G- и С-окрашивания [11, 12] были исследованы образцы лимфоцитов периферической крови у 115 детей с умственной отсталостью, аутизмом и/или врождёнными пороками развития. Методом молекулярного кариотипирования (array CGH) были исследованы несбалансированные геномные вариации в соответствии с ранее описанными протоколами [6, 7]. Для проведения исследования методом array CGH использовалась платформа, содержащая около 2,7 млн проб. Пациенты, у которых выявлялись потери генетического материала, были также обследованы с помощью флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) [11, 12, 15]. Помимо этого, все обнаруженные вариации генома для оценки их влияния на фенотип анализировались с помощью оригинальной биоинформатической технологии, описанной в предыдущих работах [6].

Результаты исследования и их обсуждение

В работе обследовано 115 детей, средний возраст которых составлял 5 лет 3 месяца (от 9 мес. до 17 лет), вышеперечисленными методами. Цитогенетический анализ позволил выявить 8 численных и структурных аномалий хромосом, причём в пяти из них выявлены какие-либо геномные нарушения при применении метода молекулярного кариотипирования. В 22 случаях не обнаружено никаких геномных аномалий. Использованная технология сканирования генома дала возможность охарактеризовать геномные перестройки с точностью до нескольких десятков нуклеотидов, а также выявить CNV и потери гетерозиготности, которые произошли за счет делеций. Все случаи хромосомных аномалий были подтверждены методом FISH. Полученные результаты представлены в таблице.

Результаты цитогенетического (кариотипирование) и молекулярно-цитогенетического (молекулярное кариотипирование – array CGH) исследований у детей с умственной отсталостью, врожденными пороками развития и аутизмом

№ п/п

Возраст

Результаты цитогенетического исследования (кариотипирование)

Аномалии, выявленные после проведения молекулярного кариотипирования (array CGH)

1

2

3

4

1

4 года

46,XX,del(6)(q11q14)

Делеция 6q11.1q14.1

2

9 мес.

46,XY,?del(1) (pter → p32.3::32.1 → qter),9phqh

Делеция 1p32.1p31.1

3

2 года

46,XX,add(8)(p23)

Делеция 8p23.3p23.1; Дупликация 8p23.1p11.22

4

4 года

47,XX,+mar,13pss

Мозаичная дупликация 17p11.2q11.1; CNV 8q24.3, 17p11.2, 19q13.41

5

8 лет

46,XX,del(8)(p23.1)[10]/46,XX[7]

Делеция 8p23.3p23.1; CNV 2q24.3

6

9 мес.

47,XXX

Трисомия хромосомы X; CNV 7q34, 19p13.2;

Интрагенные перестройки 8p23.1, 11q11.21

7

9,5 лет

46,X,+mar(delY)

Материал одной хромосомы X при наличии материала хромосомы Yp11.31q11.21; CNV 9q34.3;

Интрагенная перестройка 1q43

8

8 лет

46,XY,del(7)(q)

Делеция 7q32.3q35; Интрагенная перестройка 2q31.1

1

2

3

4

9

1 год 7 мес.

46,XX

Микроделеция 1p36.33p36.23

10

9 лет

46,XY,1qh-

Микроделеция 6p11.2

11

6 лет

46,XY,9qh+

Микроделеция 9q21.13; CNV 7q21.2

12

5 лет

45,X,22ps+[2] / 46,XY,22ps+[18]

Микроделеция Yq11.23

CNV Xp22.33, 16p13.3, 19q13.33

13

2 года 1 мес.

46,XY,9phqh

Микроделеция Yq11.23; CNV Xp22.33, Xp22.33, Xq28, 5q35.2

14

7 лет

46,XY,9phqh,21ps+

Микроделеция 16p11.2; CNV Xp22.33

15

2 года 2 мес.

46,XX,15cenh+

Микродупликация 17p13.3

Микроделеция 19p13.3

CNV 5q22.2, 7p12.3

16

6 лет

46,XY.15cenh+

Мозаичная микродупликация 11p14.3 CNV Yq11.23, 13q34

17

11 лет

46,XY

Микроделеция 15q11.2q13.1; CNV 6q22.31, 9q21.11

18

1 год 2 мес.

46, XX,1phqh,9qh+, 15cenh+

Микроделеция 16p12.1; CNV 10p13, 17q25.3;

Интрагенная перестройка Xq28

19

10 лет

46,XX

Микроделеция Xq21.1; CNV Xq13.1, Xq28;

Интрагенные перестройки 2q23.1,3p22.3

20

13 лет

46,XY,9phqh,21ps+

Микродупликации Yq11.223, Yq11.223q11.23; CNV 19q13.2; Интрагенные перестройки 2q22.1, 13q12.12, 13q33.3

21

3 года 7 мес.

46,XY,16qh+

Микродупликация Yq11.223q11.23; CNV Xq13.3, 7p13, 8p23.1; Интрагенные перестройки Xp11.23, 2p13.1, 5p15.33

22

4 года 4 мес.

46,XY,22pss

Микродупликация Yq11.223q11.23; CNV Xp11.3, 7p22.1

Интрагенные перестройки Xp22.2, 8q22.1

23

3 года

46,XX

Мозаичная микроделеция 2q23.3q24.2; CNV Yq11.223

Интрагенная перестройка 3q21.3

24

6 лет

46,XX

Микроделеция Xp22.12; CNV 6p21.33, 10p13

Интрагенные перестройки 1q41, 4q35.1

25

3 года

46,XY

Мозаичная микроделеция 5q14.3q15; CNV 5q35.3

Интрагенные перестройки 1q23.2, 2q33.1

26

8 лет

46,XY

Микродупликация 12p13.31; CNV 7q11.21

Интрагенная перестройка 15q26.3

27

1 год 2 мес.

45,X[2]/46,XY[28]

Микродупликация 5p13.3p13.2; CNV 2q31.1

Интрагенные перестройки Xp11.4, 4p16.3

28

4 года

46,XY

Микроделеция Yq11.23; CNV Xq28;

Потеря гетерозиготности 15q11.2

29-39

10 мес. – 13 лет (средний:

4 года)

46,XX или 46,XY

CNV в различных участках хромосом X, 1, 2, 4, 7, 8, 9, 14, 16, 19, 22

40–81

13 мес. – 12 лет 8 мес.

(средний: 5 лет 4 мес.)

46,XX или 46,XY

Сочетание CNV в различных участках всех хромосом, кроме хромосомы 2 и 13, и интрагенных перестроек в различных участках всех хромосом, кроме Y, 8, 18, 19, 20

82

1 год 7 мес.

46,XX

CNV 1p34.3, 19q13.33

Интрагенные перестройки Xp11.2, 12q21.2, 14q22.1, 15q15.2

Потеря гетерозиготности Xq23q26.3, 1p31.1p22.3, 1q43q44, 2p25.2p24.3, 3p23p22.2, 4q22.1q26, 4q34.3q35.2, 5q33.3q35.1, 9q21.11q21.13, 9q21.31q21.33, 12q21.1q22

83–89

11 мес. – 5 лет (средний: 2 года 9 мес.)

46,XX или 46,XY

Интрагенные перестройки в различных участках хромосом X, 1, 9, 11, 13, 17, 22

90–91

5–9 лет

(средний: 7 лет)

46,XX или 46,XY

Сочетание интрагенных перестроек в различных участках хромосом 1, 5, 11, 14 и потери гетерозиготности в хромосоме 11

92

1 год 10 мес.

46,XX,9phqh

Потеря гетерозиготности Хp11.4p11.1, Хq11.1q13.1, 2p12p11.2, 9q22.32q31.2, 9q33.1q34.3, 14q31.3q32.12, 17q25.1q25.3, 21q22.2q22.3

Комментируя таблицу, следует привести число пациентов с различными аномалиями генома: у трех пациентов выявлены цитогенетическими методами аномалии хромосом (размер более 5 млн пн); у двух пациентов – сочетание цитогенетически видимой аномалии и CNV; у двух пациентов – сочетание цитогенетически видимой аномалии, CNV и интрагенных вариаций числа копий ДНК; у одного ребёнка – сочетание цитогенетически видимой аномалии и интрагенных вариаций числа копий ДНК; у двух детей – субмикроскопические аномалии генома; у семи пациентов – сочетание субмикроскопических аномалий и CNV; у десяти детей – сочетание субмикроскопических аномалий, CNV и интрагенных вариаций числа копий ДНК; у одного пациента – сочетание субмикроскопической перестройки, CNV, интрагенных вариации числа копий ДНК и потери гетерозиготности; у одиннадцати пациентов выявили CNV; у сорока двух пациентов – сочетание CNV и интрагенных вариаций числа копий ДНК; у одного ребёнка – сочетание CNV, интрагенных вариаций числа копий ДНК и потери гетерозиготности; у семи пациентов – интрагенные вариации числа копий ДНК; у двух пациентов – сочетание интрагенных вариаций числа копий ДНК и потери гетерозиготности; у одного пациента – потеря гетерозиготности; у двадцати двух пациентов не было выявлено нарушений методом array CGH.

Полученные данные свидетельствуют о том, что использование метода высокоразрешающей CGH на биочипах (array CGH) представляет собой наиболее эффективный способ детекции геномных и хромосомных перестроек в группе детей с умственной отсталостью, аутизмом и врожденными пороками развития. Важно отметить, что цитогенетический анализ позволил выявить только делеции и дупликации, размер которых превышал 5 млн пн. Наиболее эффективным с точки зрения диагностики является метод array CGH. Это коррелирует с ранее полученными данными относительно исследований с применением полногеномного сканирования [2–4, 6, 8–10, 14]. Помимо этого, полученные данные позволили сделать вывод о том, что сочетание молекулярного кариотипирования и биоинформатических технологий обладает высокой эффективностью для выявления геномной патологии и определения молекулярных механизмов нарушения при умственной отсталости и аутизме. Следует отметить, что цитогенетические исследования являются тем не менее, необходимыми до проведения молекулярного кариотипирования.

Заключение

Анализ результатов нашего исследования показал, что для высокоэффективной диагностики следует использовать высокоразрешающий метод CGH на биочипах (array CGH), поскольку он не только увеличивает эффективность молекулярной диагностики, но и позволяет определить последовательности ДНК, вовлечённые в перестройки. Примечательно, что обнаруженные геномные перестройки были подтверждены методом флюоресцентной гибридизации in situ. Метод array CGH позволил охарактеризовать потерю генетического материала при микроделециях и микродупликациях с высокой точностью. Учитывая возможное развитие молекулярной терапии, полученная информация может послужить в скором времени основой для разработки тактики научно обоснованного лечения геномных заболеваний. Суммируя полученные данные, авторами был сделан вывод о том, что молекулярная диагностика требует использования таких инновационных молекулярно-цитогенетических технологий, как array CGH, и, несмотря на то, что технологии высокоразрешающей молекулярно-цитогенетической диагностики сравнительно недавно начали внедряться в медико-генетическую практику, за ними будущее.

Исследование выполнено за счет гранта Российского Научного Фонда (проект № 14-15-00411).

Работа поступила в редакцию 28.11.2014.


Библиографическая ссылка

Юров И.Ю., Юров И.Ю., Юров И.Ю., Ворсанова С.Г., Ворсанова С.Г., Ворсанова С.Г., Куринная О.С., Куринная О.С., Куринная О.С., Зеленова М.А., Зеленова М.А., Юров Ю.Б., Юров Ю.Б., Юров Ю.Б. МОЛЕКУЛЯРНОЕ КАРИОТИПИРОВАНИЕ ДЕТЕЙ С УМСТВЕННОЙ ОТСТАЛОСТЬЮ И АУТИЗМОМ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 10-6. – С. 1210-1214;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=36018 (дата обращения: 01.12.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074