Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В настоящее время серьезной проблемой современного общества является всеобщая подверженность стрессовым воздействиям (тяжелая физическая нагрузка, переохлаждение, перегревание, химический и эмоциональный стрессы и др.). По данным ВОЗ в последние годы смертность мужчин в возрасте от 35 до 44 лет от ишемической болезни сердца возросла на 60 %. Болезни сердца и сосудов поражают людей и молодого возраста ‒ 25–30 лет. Здесь находит свое отражение повреждающее действие стресса. Известно, что одним из основных механизмов в развитии нарушений, снижающих резервы здоровья при стрессе, является активация перекисного окисления липидов и рассогласование каскада химических реакций антиоксидантной системы, изменения углеводно-липидного обмена, сопровождаемые сдвигом окислительно-восстановительного равновесия и нарушением энергообеспечения организма [2, 6]. Усиление свободно-радикальных и перекисных процессов, а также оксидативный стресс лежат в основе патогенеза синдрома адаптационного перенапряжения, хронической усталости, атеросклероза и др. Перспективными корректорами метаболических изменений, возникающих при различных видах стресса, являются природные полифенольные соединения, оказывающие антирадикальное и антиоксидантное действие [5, 9, 10]. Это делает актуальным изучение глубоких биохимических механизмов их влияния на организм и возможность фармакологической профилактики стресса. Природные ресурсы Дальнего Востока предоставляют широкие возможности для создания разнообразных фитопрепататов. В настоящей работе был использован водно-спиртовый экстракт из осей соцветий винограда амурского (Vitis amurensis), в составе которого содержится до 65 % фенольных соединений (лейкоантоцианы, катехины, флавонолы, лигнин и др.). В качестве препарата сравнения использовали известный стресс-протектор – аптечный экстракт элеутерококка.

Целью исследования явилось изучение нарушений липидного состава крови крыс при остром стрессе и их коррекция экстрактом из осей соцветий винограда амурского.

Материалы и методы исследования

Суховоздушное сырье экстрагировали 40 % этиловым спиртом методом реперколяции. Выход экстракта составлял 1 л на 1 кг сырья. Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180–200 г, содержавшихся на стандартном рационе питания и в стандартных условиях вивария. Экспериментальную модель острого стресса воспроизводили путем вертикальной фиксации крыс за дорзальную шейную складку на 22 часа. Препараты вводили животным перорально 2 раза в течение эксперимента (до вертикальной фиксации и через 4 часа после). Водные растворы комплекса полифенолов из осей соцветий винограда и элеутерококка (предварительно освобожденные от спирта экстракты путем упаривания в вакууме) вводили в количестве 100 мг/кг массы тела общих полифенолов, что соответствует известной терапевтической дозе для полифенольных гепатопротекторов [3]. Животные были разделены на четыре группы по 10 крыс в каждой: 1-я – контроль (интактные животные), 2-я – стресс, 3-я – стресс + экстракт из осей соцветий винограда, 4-я – стресс + экстракт элеутерококка. Крыс выводили из эксперимента путем декапитации под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Кровь брали из шейной вены. После повреждающего воздействия измеряли массу надпочечников и количество изъязвлений на слизистой желудка. Исследование одобрено Комиссией по вопросам этики Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН.

Липиды из сыворотки крови экстрагировали по методу J. Folch et al. [8]. Разделение нейтральных липидов проводили методом одномерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле в системе растворителей гексан – серный эфир – уксусная кислота (90:10:1 по объему) [7]. Обнаружение пятен нейтральных липидов осуществляли с помощью паров йода, а их идентификацию – с применением очищенных стандартов. Фракционное разделение фосфолипидов осуществляли методом двумерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле [11], а их идентификацию и количественное определение по методу V.E. Vaskovsky et al. [12]. Количественное содержание отдельных фракций выражали в % от суммы нейтральных липидов и фосфолипидов. Обработку результатов проводили с использованием статистического пакета Instat 3.0 (GraphPad Software Inc. USA, 2005) со встроенной процедурой проверки соответствия выборки закону нормального распределения. Для определения статистической значимости различий в зависимости от параметров распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна – Уитни. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Вертикальная фиксация крыс за дорзальную шейную складку вызывала формирование типичной картины стресса с характерными геморрагическими деструкциями желудка и гипертрофией надпочечников, масса которых повысилась на 42 % (8,43 ± 0,25 мг/100 г массы против 5,94 ± 0,55 мг/100 г массы в контроле; р < 0,001). Количество изъязвлений на слизистой желудка составило 2,7 ± 0,08 ед/жив., в контроле 0. Изучение липидного состава сыворотки крови животных 2-й группы (таблица) характеризовалось увеличением свободных жирных кислот на 33 % по сравнению с контролем, что связано с активизацией периферического липолиза в жировой ткани в ответ на выброс в кровь катехоламинов (стрессовая реакция). Увеличение содержания триацилглицеринов в сыворотке крови на 22 % по сравнению с контрольными величинами объясняется насыщением ими вновь синтезируемых в печени липопротеинов. Известно, что при стрессе в печени происходит ресинтез триацилглицеринов из жирных кислот и глицерина, мобилизуемых при липолизе, что способствует ее жировой инфильтрации.

Увеличение уровня холестерина на 20 % обусловлено активацией его синтеза из ацетил-КоА, так как при стрессе происходит избыточное образование ацетата из жирных кислот в связи с усилением их распада при липолизе [4].

Уменьшение содержания эфиров холестерина на 17 % свидетельствует о нарушении этерифицирующей функции печени и, как следствие, синтеза и катаболизма липопротеинов с преобладанием липопротеинов низкой плотности. При этом роль липидов в энергетике организма в условиях острого стресса значительно возрастает. Энергетический обмен переключается с «углеводного» типа на «липидный», что характерно для стадии резистентности стресса [4, 6]. Среди фосфолипидных фракций характерно отметить достоверное снижение фосфатидилхолина на 7 %, фосфатидилэтаноламина на 14 % при одновременном увеличении лизофосфатидилхолина на 24 % и лизофосфатидилэтаноламина на 32 %. Обращает на себя внимание высокий уровень сфингомиелина (на 36 %). Рост лизофракций обусловлен активацией фосфолипаз, тогда как увеличение сфингомиелина является компенсаторной реакций на повышение проницаемости мембран.

Влияние растительных препаратов на содержание нейтральных липидов и фосфолипидов в сыворотке крови крыс при стрессе (% от суммы всех фракций; М ± m)

Примечание. Различия статистически достоверны при: 1 – р < 0,05; 2 – р < 0,01; 3 – р < 0,001 по сравнению с контролем. ТАГ – триацилглицерины, СЖК – свободные жирные кислоты, ЭЖК – эфиры жирных кислот, ХС – холестерин, ЭХС – эфиры холестерина, ФХ – фосфатидилхолин, ЛФХ – лизофосфатидилхолин, СМ – сфингомиелин, ФЭ – фосфатидилэтаноламин, ЛФЭ – лизофосфатидилэтаноламин, ФС – фосфатидилсерин, ФИ – фосфатидилинозит, ФК – фосфатидная кислота, ДФГ – дифосфатидилглицерин

При введении экспериментальным животным экстракта из осей соцветий винограда (3-я группа) или экстракта элеутерококка (4-я группа) в период стресса наблюдалась коррекция вызванных им нарушений биохимических показателей сыворотки крови (таблица). В группе животных, получавших экстракт из осей соцветий винограда, по сравнению со 2-й группой (стресс), на 23 % снизилась гипертрофия надпочечников (6,53 ± 0,23 мг/100 г; р < 0,01), тогда как при введении элеутерококка – на 9 % (7,67 ± 0,13 мг/100 г; р < 0,05). Отсутствовали изъязвления на слизистой желудка. Данный феномен объясняется тем, что молекулы полифенолов, взаимодействуя с поверхностью слизистой желудка, способны образовывать мономолекулярные слои, увеличивающие прочность поверхностного слоя клеток [1], соответственно, снижая возможность язвообразования.

При исследовании показателей липидного обмена в сыворотке крови крыс 3-й группы обращает на себя внимание сохранение содержания фракций нейтральных и фосфолипидов на уровне контроля (таблица). В то же время в 4-й группе сохраняется достоверно повышенный, относительно контроля, уровень свободных жирных кислот (на 25 %), холестерина (на 10 %), лизофосфатидилхолина (на 19 %), лизофосфатидилэтаноламина (на 39 %), сфингомиелина (на 13 %), а также пониженный уровень эфиров холестерина (на 8 %) и дифосфатидилглицерина (на 12 %). Анализируя полученные результаты, можно предположить, что растительные полифенолы снижают эффект выброса катехоламинов надпочечниками при стрессе, что подтверждается уменьшением их гипертрофии. Это влечет за собой меньшую активность липолиза в жировой ткани, в результате чего величины триацилглицеринов и свободных жирных кислот в сыворотке крови сохраняются на уровне контроля. Также сохраняется этерифицирующая функция печени, но степень выраженности в росте эфиров холестерина в 3-й и 4-й группах относительно 2-й группы (стресс) различается. Так, при введении экстракта из осей соцветий винограда функция эфирообразования была более интенсивной (увеличение на 22 %), чем таковая при введении элеутерококка (увеличение на 13 %). Это важный показатель, так как предполагает сохранение синтеза фосфолипидов, блокируемого при стрессе [4]. Кроме этого, экстракт из осей соцветий винограда значительно превосходил экстракт элеутерококка по способности снижать гипертрофию надпочечников. По остальным показателям экстракт из осей соцветий винограда проявлял свойства, сходные с таковыми у экстракта элеутерококка. Наряду с элеутерококком экстракт из осей соцветий винограда может быть рекомендован в качестве стресс-протекторного средства.

Выводы

1. Применение экстракта из осей соцветий винограда амурского при стресс-воздействии сопровождалось выраженным стресс-протекторным действием, которое проявлялось в восстановлении массы надпочечников и нормализации липидного обмена.

2. Механизм стресс-протекторного действия комплекса биологически активных веществ экстракта из осей соцветий винограда амурского и экстракта элеутерококка обусловлен тем фактом, что растительные полифенолы, входящие в их состав, имеют способность улавливать свободные оксигенные и пероксильные радикалы, образуя при этом относительно стабильный феноксил-радикал, который сдерживает процессы перекисного окисления липидов и снимает состояние оксидативного стресса.

3. По исследованным показателям экстракт из осей соцветий винограда амурского показывает более высокую биологическую активность, чем таковая у препарата сравнения «Экстракт элеутерококка®».

4. Оси соцветий винограда амурского являются перспективным видом сырья для получения стресс-протекторных препаратов, содержащих флавоноиды.

Работа поддержана Министерством образования и науки РФ, проект № 1326.

Рецензенты:

Богданович Л.Н., д.б.н., заведующая лабораторией инновационных медико-биологических исследований и технологий, ФГБУЗ Медицинское объединение ДВО РАН, г. Владивосток;

Палагина М.В., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией фундаментальных и прикладных проблем товароведения, Школа экономики и менеджмента Дальневосточного федерального университета, г. Владивосток.

Работа поступила в редакцию 17.10.2014.