Одним из важнейших этапов развития опухоли считается ее способность индуцировать и поддерживать ангиогенез. Изучение молекулярных механизмов ангиогенеза показало, что динамический баланс, обеспечивающий формирование и развитие новых сосудов внутри опухоли, зависит от про- и антиангиогенных факторов [2, 7]. Основным активатором ангиогенеза считают фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), ответственный за пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, а также имеющий непосредственное отношение к инвазии и метастазированию опухоли [8, 9, 12]. Накоплены данные, подтверждающих участие VEGF и эпидермального фактора роста (EGF) в построении сосудистого русла, росте и прогрессии злокачественных новообразований. Причем взаимодействие этих лигандов с трансмембранными тирозинкиназными рецепторами рассматривают как важнейший аутокринный путь промоции опухоли [6]. Непосредственное отношение к активации факторов роста и процессам неоангиогенеза в опухоли имеет тканевая система активации плазминогена [10]. Ключевую роль в активации образования ассоциированных с опухолью протеиназ играют активаторы плазминогена [1].
Целью настоящего исследования явилось изучение в ткани эндофитной и экзофитной форм рака шейки матки уровня ростовых факторов и их рецепторов, антигена плоскоклеточной карциномы и некоторых компонентов системы активации плазминогена.
Материалы и методы исследования
Были изучены ткани опухоли, ее перифокальной зоны, визуально неизмененные ткани, полученные при оперативном лечении 46 больных с гистологически подтвержденным плоскоклеточным раком шейки матки (эндофитной – n = 22 и экзофитной – n = 24 формы роста) T1б-2аN0M0 стадии процесса. Стадирование рака шейки матки проводилось в соответствии с классификацией TNM (UICC, версия 2002 г.). Диагностика рака основывалась на результатах гистологического исследования в соответствии с отраслевыми стандартами и алгоритмами объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований в онкологии. Критерием отбора больных являлся радикально резектабельный, морфологически подтвержденный диагноз рака шейки матки.
Гистологический анализ опухоли при обоих вариантах роста, выбранных в качестве объекта исследования, плоскоклеточный рак без ороговения.
Все больные были позднего репродуктивного и перименопаузального возраста.
Тканью перифокальной зоны считали образцы на расстоянии 1 см от видимого края опухоли. Образцы опухоли, ее перифокальной зоны и неизмененной ткани были взяты во время операции и заморожены для дальнейшего хранения при температуре –70 °С.
Уровень VEGF, VEGFR (BenderMedSystem, USA), EGF, EGFR (BCMDiagnostics, USA), SСC (FUJIREBIO, Швеция), плазмина, u-PA и t-PA(Technoclone, Австрия) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартных тест-систем в 10 % цитозольных фракциях, приготовленных на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7,4, содержащим 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА.Активность плазминогена определяли в указанных образцах спектрофотометрическим методом с помощью тест-систем (SekisuiDiagnostics, USA).
В каждом конкретном случае было получено добровольное информированное согласие больных на использование материалов для проведения научных исследований.
Данные обрабатывались при помощи пакета статистических программ «STATISTICA-6», разработанного фирмой Statsoft (USA). При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.
Результаты исследования и их обсуждение
Учитывая различия в возрастном составе больных в группах с эндофитным и экзофитным раком шейки матки, мы сочли целесообразным сравнить уровень ростовых факторов, маркера плоскоклеточного рака и показателей системы активации плазминогена в визуально неизмененной ткани. Необходимо отметить, что мы не обнаружили различий в уровне исследуемых показателей, связанных с возрастом.
Было установлено, что при эндофитной форме в визуально неизмененной ткани содержание VEGF иVEGF-R было на 25,6 и 43,1 % соответственно ниже, а их соотношение VEGF/ VEGF-R на 23,5 % выше, чем в аналогичной ткани при экзофитах. Напротив, в визуально неизмененной ткани эндофитов уровень EGF был на 24,8 % выше, чем в экзофитах, EGF-R не имел достоверных отличий и, естественно, соотношение EGF/ EGF-R также было в 1,8 раза выше (табл. 1, 2).
Уровень SSC в визуально неизмененной ткани рака шейки матки при эндофитной и экзофитной формах не имел достоверных отличий (табл. 1, 2).
Таблица 1
Уровень факторов роста, их рецепторов и антигена плоскоклеточной карциномы в тканях шейки матки при эндофитном варианте роста опухоли
|
Показатели |
Ткань опухоли |
Ткань перифокальной зоны |
Визуально неизмененная ткань |
|
VEGF, пг/г тк |
1184,3 ± 96,41,3 |
477,9 ± 36,51,2,3 |
167,1 ± 14,23 |
|
VEGF-R, нг/г тк |
32,6 ± 3,11 |
5,7 ± 0,51,2,3 |
4,1 ± 0,43 |
|
VEGF/ VEGF-R |
36,3 ± 3,53 |
83,8 ± 7,91,2,3 |
40,8 ± 3,83 |
|
EGF, пг/г тк |
102,7 ± 8,31,3 |
76,3 ± 5,42,3 |
83,1 ± 7,23 |
|
EGF-R, нг/г тк |
176,3 ± 14,61 |
136,4 ± 11,82 |
119,6 ± 13,3 |
|
EGF/ EGF-R |
0,58 ± 0,063 |
0,56 ± 0,073 |
0,69 ± 0,073 |
|
SСC, мкг/гтк |
149,9 ± 10,61 |
76,7 ± 6,11,2,3 |
47,8 ± 5,2 |
Примечания:1 – достоверно по отношению к показателю в визуально неизмененной ткани; 2 – достоверно по отношению к показателю в ткани опухоли; 3 – достоверно по отношению к показателю при экзофитном росте опухоли. Уровень показателей нормирован на грамм влажной ткани.
В ткани злокачественной опухоли шейки матки уровень VEGF был резко повышен относительно соответствующих визуально неизмененных тканей: при эндофитной форме роста опухоли – в 7,1 раза, при экзофитной – 14,8 раза. Очевидно, что показатель имел выраженные отличия при различных формах роста опухоли: при экзофитах уровень VEGF превосходил аналогичный показатель в ткани эндофита в 2,8 раза (табл. 1, 2).
В ткани злокачественной опухоли, вне зависимости от формы роста, содержание растворимого рецептора VEGF-R было увеличено относительно соответствующих визуально неизмененных тканей: при эндофитной форме роста опухоли в 8 раз, при экзофитной – 3,8 раза, однако не имело достоверных отличий между эндофитной и экзофитной формами роста рака шейки матки.
Наши результаты согласуются с данными ряда авторов, показавшими увеличение содержания VEGF и VEGFR в опухолях молочной железы и почки по сравнению с гистологически неизмененными тканями, не связанное с возрастом больных [2, 5].
Таблица 2
Уровень факторов роста, их рецепторов и антигена плоскоклеточной карциномы в тканях шейки матки при экзофитном варианте роста опухоли
|
Показатели |
Ткань опухоли |
Ткань перифокальной зоны |
Визуально неизмененная ткань |
|
VEGF, пг/г тк |
3320,7 ± 216,51 |
265,5 ± 23,12 |
224,6 ± 21,8 |
|
VEGF-R, нг/г тк |
27,7 ± 2,41 |
33,4 ± 3,11,2 |
7,2 ± 0,7 |
|
VEGF/ VEGF-R |
119,9 ± 10,21 |
7,9 ± 0,61,2 |
31,2 ± 2,9 |
|
EGF, пг/г тк |
192,9 ± 17,41 |
53,8 ± 4,62 |
62,5 ± 4,9 |
|
EGF-R, нг/г тк |
191,4 ± 18,31 |
152,1 ± 12,42 |
145,2 ± 14,2 |
|
EGF/ EGF-R |
1,0 ± 0,081 |
0,35 ± 0,032 |
0,4 ± 0,04 |
|
SСC, мкг/гтк |
161,7 ± 13,81 |
37,6 ± 3,22 |
41,3 ± 3,8 |
Примечания: 1 – достоверно по отношению к показателю в визуально неизмененной ткани; 2 – достоверно по отношению к показателю в ткани опухоли; 3 – достоверно по отношению к показателю при экзофитном росте опухоли. Уровень показателей нормирован на грамм влажной ткани.
Соотношение VEGF/ VEGF-R в ткани экзофитной опухоли было в 3,3 раза выше, чем при эндофитной. Однако при сравнении соотношения VEGF/ VEGF-R в ткани опухоли при разной форме роста с показателями в соответствующей визуально неизмененной ткани получены интересные результаты. Так, в ткани экзофитной опухоли показатель VEGF/VEGF-R превосходил аналогичные значения в соответствующей визуально неизмененной ткани в 3,8 раза, тогда как при эндофитной форме роста опухоли не имел достоверных отличий (табл. 1, 2).
На наш взгляд, факт повышения уровня VEGF может определять один из важных клинических признаков экзофитной опухоли, а именно ее повышенную кровоточивость. Поскольку клетки эндотелия во вновь образованных сосудах опухоли не образуют нормального монослоя, они не могут выполнять обычную барьерную функцию эндотелия [4, 11]. Как известно, большие концентрации VEGF являются мощным фактором повышения проницаемости сосудов [13], что может обусловить аномально высокую проницаемость опухолевой сосудистой сети и ее склонности к кровотечениям. С другой стороны, учитывая, что растворимый VEGF-R представляет собой ингибитор VEGF, можно предполагать, в ткани эндофитной опухоли VEGF-А – сигнальный путь ангиогенеза не активирован относительно визуально неизмененной ткани, т.е. в самой опухоли не происходит повышенное образование патологических кровеносных сосудов. Напротив, в ткани экзофитной опухоли этот процесс активно протекает. С другой стороны, известно что, эндофитные опухоли шейки матки имеют обширную сеть лимфатических сосудов, что способствует местному распространению процесса по типу инфильтрации окружающих тканей. В этом можно рассмотреть индивидуальные особенности различных форм роста рака шейки матки.
Уровень EGF и EGF-R в ткани опухоли шейки матки вне зависимости от ее формы роста был повышен относительно соответствующей визуально неизмененной ткани: при эндофите – на 23,6 и 47,4 %, при экзофите – в 3,1 и 1,3 раза соответственно. Показатель EGF/ EGF-R в ткани эндофитной опухоли не имел достоверных отличий от значений в визуально неизмененной ткани, а при экзофитной был выше в 2,3 раза.
Известно, что EGF может индуцировать процессы опухолевого ангиогенеза за счет гиперэкспрессии VEGF [9]. При ряде опухолей эпителиальной природы обнаруживается избыточная экспрессия EGFR и/или EGF, что приводит к повышенной пролиферативной активности трансформированных клеток и, как правило, ассоциируется с метастатическим фенотипом заболевания и, соответственно, коррелирует с плохим прогнозом [6].
Полученные результаты, с одной стороны, можно трактовать как участие EGF в процессе активации VEGF в ткани опухоли, особенно выраженную при экзофитной форме роста. С другой стороны, сравнение показателей EGF/EGF-R в ткани опухоли и соответствующей визуально неизмененной ткани, а также последней при различных формах роста, указывает на повышенную пролиферативную активность только клеток ткани опухоли при экзофитном росте и повышенную пролиферативную активность всех исследуемых образцов при эндофитном, что подтверждается в клинике стимуляцией опухолевой инфильтрации окружающих тканей при этой форме роста. Уровень SСC в ткани рака шейки матки при эндофитной и экзофитной формах не имел достоверных отличий и был в 3,1 и 3,9 раза выше, чем в соответствующих визуально неизмененных тканях (табл. 1, 2).
Результаты изучения показателей тканевой фибринолитической системы в тканях шейки матки при различных вариантах роста злокачественной опухоли представлены в табл. 3, 4. Обнаружены некоторые различия показателей тканевой фибринолитической системы в визуально неизмененной ткани при различных формах рака шейки матки. Так, уровень плазмина при эндофитной форме был в 1,4 раза выше, а плазминогена – в 1,4 ниже, чем при экзофитной форме. Еще одним отличием было различное содержание урокиназы: в визуально неизмененной ткани при эндофитах этот показатель был снижен относительно значений при экзофитах в 3,8 раза, без изменения ее активности. Содержание и активность тканевого активатора плазминогена tPA не имело достоверных отличий.
Таблица 3
Показатели активности системы активации плазминогена в тканях шейки матки при эндофитном варианте роста опухоли
|
Показатели |
Ткань опухоли |
Ткань перифокальной зоны |
Визуально неизмененная ткань |
|
Плазмин, нг/г тк |
474,1 ± 42,53 |
434,7 ± 35,43 |
408,1 ± 37,83 |
|
Плазминоген, Pg/г тк |
2,1 ± 0,2 |
2,1 ± 0,16 |
2,0 ± 0,143 |
|
uPA активность, ед/г тк |
0,7 ± 0,051,3 |
0,4 ± 0,062 |
0,3 ± 0,04 |
|
uPA содержание, ед/г тк |
42,7 ± 3,91 |
15,1 ± 1,31,2,3 |
7,4 ± 0,63 |
|
tPA активность, ед/г тк |
3,8 ± 0,43 |
5,1 ± 0,52 |
4,8 ± 0,6 |
|
tPA содержание, ед/г тк |
61,4 ± 4,93 |
50,8 ± 3,62,3 |
60,1 ± 5,9 |
Примечания:1 – достоверно по отношению к показателю в визуально неизмененной ткани; 2 – достоверно по отношению к показателю в ткани опухоли; 3 – достоверно по отношению к показателю при экзофитном росте опухоли. Уровень показателей нормирован на грамм влажной ткани.
В ткани опухоли при эндофитной форме роста уровень плазмина и плазминогена относительно визуально интактной ткани не имел достоверных отличий. При экзофитной форме роста в ткани опухоли содержание плазмина было выше, чем в соответствующей визуально неизмененной ткани на 24,4 %, а плазминогена, напротив, – на 28,6 % ниже.
Были выявлены различия и в системе активаторов плазминогена. Так, в ткани опухоли при эндофитной форме роста относительно визуально неизмененной ткани нарастал уровень и активность uPA в 5,8 и 2,3 раза соответственно, без выраженных изменений уровня и активности tPA. Напротив, в ткани опухоли при экзофитной форме роста относительно визуально неизмененной ткани нарастал уровень и активность tPAв 2,1 и 1,5 раза соответственно, без выраженных изменений активности uPA.
В ткани перифокальной зоны опухоли вне зависимости от формы ее роста изученные показатели не имели достоверных отличий от значений в визуально неизмененной ткани шейки матки.
На первый взгляд, создается впечатление, что в ткани эндофитной опухоли относительно визуально неизмененной ткани и ткани перифокальной зоны меняется только содержание uPA и повышена его активность. Тогда логично предположить, что именно урокиназа, без активации плазминогена и перехода его в плазмин, участвует в экспрессии фактора роста эндотелия сосудов VEGF, как описано в данных литературы [3]. А в ткани опухоли при экзофитной форме роста активация ростовых факторов происходит через активацию плазминогена в плазмин посредством тканевого активатора. Однако если вернуться к разнице показателей в визуально неизмененной ткани при обоих вариантах роста опухоли, можно предположить, что, в отличие от экзофитов, при эндофитах отмечается более выраженная стимуляция системы активации плазминогена с участием uPA, а не tPA, во всех исследуемых образцах, а именно в визуально неизмененной ткани, злокачественной опухоли и ее перифокальной зоне.
Таблица 4
Показатели активности системы активации плазминогена в тканях шейки матки при экзофитном варианте роста опухоли
|
Показатели |
Ткань опухоли |
Ткань перифокальной зоны |
Визуально неизмененная ткань |
|
Плазмин, нг/г тк |
396,2 ± 25,61 |
319,8 ± 28,42 |
299,4 ± 23,8 |
|
Плазминоген, Pg/г тк |
2,0 ± 0,21 |
2,9 ± 0,32 |
2,8 ± 0,3 |
|
uPA активность, ед/г тк |
0,4 ± 0,06 |
0,3 ± 0,032 |
0,3 ± 0,04 |
|
uPA содержание,ед/г тк |
43,2 ± 3,71 |
34,8 ± 3,22 |
28,4 ± 3,4 |
|
tPA активность, ед/г тк |
7,2 ± 0,61 |
4,3 ± 0,52 |
4,8 ± 0,5 |
|
tPA содержание, ед/г тк |
147,6 ± 12,51 |
77,6 ± 5,42 |
69,1 ± 5,3 |
Примечания:1 – достоверно по отношению к показателю в визуально неизмененной ткани; 2 – достоверно по отношению к показателю в ткани опухоли. Уровень показателей нормирован на грамм влажной ткани.
Таким образом, выявленные закономерности экспрессии факторов роста, обусловленные особенностями активации компонентов системы активации плазминогена, вероятно, определяют различное клиническое течение экзофитных и эндофитных злокачественных опухолей шейки матки.
Рецензенты:
Каймакчи О.Ю., д.м.н., ассистент кафедры онкологии Ростовского государственного медицинского университета, г. Ростов-на-Дону;
Николаева Н.В., д.м.н., ассистент кафедры онкологии Ростовского государственного медицинского университета, г. Ростов-на-Дону.
Работа поступила в редакцию 15.09.2014.