В настоящее время установлено, что существует не менее пяти типов дофаминовых рецепторов. Их принято объединять в два семейства – семейство рецептора Д1 (Д1и Д5) и семейство рецептора Д2 (Д2, Д3, Д4) [3]. Количество и распространение Д1- и Д2-рецепторов в ткани мозга выше, чем Д3 и Д4. Это предопределяет, что именно Д1 и Д2-рецепторы играют ведущую роль в реализации различных функций и в развитии патологии нервной системы.
Д1 и Д2-рецепторы имеют разную аффинность по отношению к дофамину. Афинность Д2-рецепторов от 10 до 100 раз больше аффинности Д1-рецепторов [11]. Эти различия предполагают разную роль этих рецепторов в выделении дофамина. Выделившийся дофамин достигает постсинаптического компонента, приводя к формированию и реализации целенаправленного поведения [7].
Выделено две изоформы м-РНК Д2-рецептора, которые получили названия длинной (D2L) и короткой (D2S). Они образуются в результате альтернативного сплайсинга гетероядерной РНК, синтезируемой на шестом экзоне гена этого рецептора [6]. Короткая изоформа рецептора отличается от длинной тем, что у нее отсутствует 29 аминокислот, входящих в состав третьей цитоплазматической петли рецептора [3].
Показано, что изоформы имеют различную локализацию на компонентах синапсов. Длинная изоформа (D2L) локализуется на постсинаптическом компоненте синапсов, в то время как D2S располагается пресинаптически и выполняет функции ауторецептора [12]. Основная роль ауторецепторов сводится к торможению синтеза и выделения дофамина. Результаты исследований Zhang et al. [15] и Moyer et al. [10] показали, что наличие аллеля А1 в локусе Taq 1 A DRD2 приводит к снижению экспрессии короткой изоформы рецептора, вследствие чего повышается синтез и выделение дофамина из пресинаптического компонента.
Целью исследования явился сравнительный анализ двигательной активности и исследовательской деятельности крыс, имеющих различия в экспрессии изоформ Д2-рецептора, ассоциированные с полиморфными вариантами локуса Taq 1 DRD2.
Материал и методы исследования
Исследования проведены на двух группах (в каждой группе было по 66 крыс, равное количество самцов и самок) половозрелых гомозиготных крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2) с массой тела 250–320 г. Две субпопуляции крыс линии WAG/Rij впервые получены на кафедре МФЧЖ БашГУ путем скрещивания гомозиготных особей, выявленных генетическим анализом указанного локуса в исходной популяции этих крыс (Калимуллина и др., 2005). Генетический анализ полиморфного локуса Taq 1 A DRD2 у крыс линии WAG/Rij был выполнен под руководством заведующего отделом геномики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН профессора Э.К. Хуснутдиновой.
Всех использованных в работе половозрелых крыс содержали в стандартных условиях вивария, характеризующихся постоянством комнатной температуры (20–22 °С) и уровнем влажности. Пищу и питьё животные получали ad libitum, продолжительность светового дня составляла 12–14 часов. Все процедуры с животными выполняли с соблюдением международных правил и норм (Eropean Communities Council Directives,1986).
Ориентировочно-исследовательское поведение крыс в условиях новизны обстановки изучали в установке «открытое поле». Оно представляло собой квадратную освещенную в центре (лампой 40 Вт) арену площадью 100 см2, разделенную на 16 равных частей. Регистрировали показатели горизонтальной и вертикальной активности, определяли количество эпизодов и время, затрачиваемое крысой на груминг (чесательный рефлекс), пребывание в состоянии неподвижности и латентный период до пересечения первого квадрата (амбуляции). Вегетативные реакции крыс регистрировали на основании учета числа уринаций и болюсов. В данной статье проведен анализ двигательной активности и исследовательской деятельности.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 6.0. Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью параметрического критерия Стьюдента и непараметрического критерия U-критерий Манна – Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты исследований и их обсуждение
Результаты, полученные при регистрации поведения двух групп экспериментальных крыс, имеющих генотипы А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1 A DRD2, приведены в таблице.
Показатели поведения в тесте «открытое поле» крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 локуса Taq1A DRD2 (M ± m)
|
Параметры поведения |
Генотип |
t-value |
p |
|
|
А1/А1 |
А2/А2 |
|||
|
Количество пересеченных квадратов в центре поля |
7,82 ± 0,53 |
3,05 ± 0,32 |
7,11 |
< 0,001 |
|
Количество пересеченных квадратов на периферии поля |
74,70 ± 2,72 |
43,68 ± 2,49 |
8,01 |
< 0,001 |
|
Общая двигательная активность |
82,70 ± 3,09 |
46,73 ± 2,75 |
8,26 |
< 0,001 |
|
Количество совершенных стоек в центре поля |
1,42 ± 0,14 |
0,53 ± 0,09 |
4,80 |
< 0,001 |
|
Количество совершенных стоек на периферии поля |
19,21 ± 0,95 |
8,35 ± 0,84 |
7,92 |
< 0,001 |
|
Общее количество совершенных стоек |
20,63 ± 1,04 |
8,88 ± 0,88 |
7,95 |
< 0,001 |
|
Неподвижность (с) |
1,12 ± 0,26 |
9,80 ± 3,17 |
3,08 |
< 0,01 |
Данные таблицы показывают, что по числу пересеченных квадратов в центре поля у крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2 существуют высоко значимые различия. Средние значения, приведенные по данному параметру, указывают на сниженную в два раза посещаемость центра открытого поля животными с генотипом А2/А2. Сравнение среднего количества пройденных квадратов на периферии поля крысами с генотипом А2/А2 также достоверно меньше, чем у крыс с генотипом А1/А1, что показывает, что локомоторная активность у крыс с генотипом А2/А2 снижена. По общей двигательной активности (числу амбуляций), которую мы определяли как совокупность числа пересеченных квадратов в центре и на периферии поля, нами установлено значимое различие между крысами двух изученных групп. Горизонтальная активность достоверно выше у крыс с генотипом А1/А1 по сравнению с крысами с генотипом А2/А2.
При выявлении различий в поведении двух групп крыс оказался статистически значим параметр неподвижности. Он в десять раз выше у крыс с генотипом А2/А2, что проявлялось в их заторможенном состоянии и низкой исследовательской активности.
Анализ исследовательской деятельности показал, что количество стоек, совершенных в среднем за все дни тестирования крысами с генотипом А1/А1 в центре «открытого поля» в три раза больше аналогичного показателя у крыс с генотипом А2/А2 (p < 0,001). На периферии «открытого поля» крысы с генотипом А1/А1 в среднем за все дни тестирования совершили в два раза больше стоек по сравнению с крысами с генотипом А2/А2 (p < 0,001). Естественно, что при наличии различий исследовательской деятельности в центре и на периферии поля сравнение показателей общей исследовательской деятельности также выявило статистически достоверные различия (p < 0,001).
Итак, выполненный анализ поведения позволил выявить значимые различия в поведении двух изучаемых групп крыс. У крыс с генотипом А2/А2 при тестировании в «открытом поле» мы наблюдали частые замирания, при этом животные находились в состоянии пассивного бодрствования, но у них отсутствовали любые локомоторные акты. Крысы с генотипом А1/А1 подобного состояния практически не проявляли, они стремились исследовать как можно больше незнакомого пространства, демонстрируя высокую горизонтальную и вертикальную активность.
Методика изучения поведения грызунов в «открытом поле» является одним из самых популярных тестов в нейробиологии поведения и широко используется в нейрогенетике поведенческого фенотипирования разных линий, а также трансгенных и мутантных животных [2].
Исследование ориентировочно-исследовательского поведения двух групп крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 показало, что популяция крыс (самцы + самки) с генотипом А1/А1 DRD2 характеризуется большей двигательной активностью и более интенсивной исследовательской деятельностью по сравнению с крысами с генотипом А2/А2.
Полученные результаты выявили ассоциацию генотипа А1/А1 по локусу Taq 1 A DRD2 с гиперактивностью в «открытом поле», в то время как генотип А2/А2 по этому локусу проявлял себя противоположными нейрофенотипическими характеристиками – меньшей двигательной активностью и менее интенсивной исследовательской деятельностью.
Обнаруженные различия хорошо объяснимы на основании результатов исследований по молекулярной генетике. Показано, что аллель А1 локуса Taq 1 A DRD2 находится в неравновесии по сцеплению (D’ = 0,855) с минорными аллелями (Т) двух фланкирующих 6 экзон интронных локусов (rs 2283265 и rs 1076560) этого гена, снижающими экспрессию короткой изоформы рецептора (D2S). Приведенные данные Zhang et al. [15] подтверждены и Jocham et al. [8], показавшими наличие неравновесия по сцеплению между локусами rs 1800497 and rs 2283265 (D’ = 0,78). Так как DRD2 у крысы на 95 % гомологичен с этим геном человека [9], можно полагать, что выявленная закономерность имеет место и у крыс. Известно, что снижение экспрессии короткой изоформы D2 и изменение в силу этого соотношения длинной и короткой изоформ приводит к повышению синтеза и выделения дофамина, что предопределяет повышение его содержания в тканях мозга [5, 12 и др.].
Выяснено, что активация D2S нарушает синтез и выделение дофамина, ограничивая эти процессы, и приводит к снижению двигательной активности, в то время как активация D2L повышает локомоторную активность [4]. Показано, что сигнал-трансдукторные пути, реализующие влияние D2S и D2L на функциональное состояние нейронов путем воздействия на транскрипционные факторы, имеют специфические особенности, объясняющие различия вызываемых ими эффектов [13].
Приведенные сведения литературы объясняют особенности поведения крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2. У крыс с генотипом А1/А1 снижение экспрессии D2S ведет к повышению синтеза и выделения дофамина из пресинаптической терминали дофаминергического синапса, проявлением чего является гиперактивность этих животных. У крыс с генотипом А2/А2, исходя из выявленных особенностей ориентировочно-исследовательского поведения, можно предполагать изменение экспрессии D2L в пользу D2S, что и является основой их гиподинамии и сниженного содержания дофамина.
Высказанное предположение подтверждается результатами работы Wang et al. [14], которые исследовали поведение D2L-/- мышей, у которых с помощью генетических технологий (gene-targeting technology) было выполнено удаление участка гена, ответственного за экспрессию длинной изоформы рецептора. Авторы показали, что D2L-/- мыши (у которых сохранялась экспрессия только D2S, и она была повышена) по сравнению с контролем демонстрировали в установке «открытое поле» снижение двигательной активности и исследовательской деятельности.
Выводы
1. Крысы с генотипом А1/А1 по локусу Taq 1 A DRD2, определяющим снижение экспрессии короткой изоформы Д2-рецептора, при тестировании поведения в установке «открытое поле» показывают высокую двигательную активность по сравнению с крысами – носителями генотипа А2/А2.
2. Крысы с генотипом А1/А1 по локусу Taq 1 A DRD2, определяющим снижение экспрессии короткой изоформы Д2-рецептора, при тестировании поведения в установке «открытое поле» показывают более выраженную исследовательскую деятельность по сравнению с крысами – носителями генотипа А2/А2.
3. Полученные результаты свидетельствуют о том, что крысы с генотипом А1/А1 DRD2 демонстрируют активную, а крысы с генотипом А2/А2 DRD2 – пассивную стратегию ориентировочно-исследовательского поведения.
Работа выполнена при финансовой поддержке базовой части Госзадания Минобрнауки РФ, тема № 301–14.
Рецензенты:
Муфазалова Н.А., д.м.н., профессор кафедры фармакологии № 1 с курсом клинической фармакологии, Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа;
Мурзабаев Х.Х., д.м.н., профессор, зав. кафедрой гистологии, Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа.
Работа поступила в редакцию 15.09.2014.