Среди многообразия злокачественных опухолей выделяется группа новообразований различной локализации, способных синтезировать биогенные амины и многочисленный класс пептидных гормонов, источником которых являются клетки диффузной эндокринной системы – нейроэндокринные опухоли (НЭО). Несмотря на то, что НЭО относят к классу редких опухолей, их встречаемость ежегодно увеличивается. Проблема НЭО стоит чрезвычайно остро, о чем свидетельствует мировая статистика: за последние 30 лет частота выявления НЭО увеличилась в 5 раз [10]. Это обусловлено тем, что нейроэндокринные опухоли становятся все более распространенными из-за действительного увеличения случаев заболевания ими, а также благодаря улучшению диагностики данного вида злокачественных новообразований. При этом наличие очагов с эндокринной дифференцировкой, а также обнаружение эндокринных маркеров в единичных, рассеянных опухолевых клетках не является основанием для причисления данной опухоли к НЭО. К основным типам НЭО следует отнести эпителиальные новообразования, которые происходят из клеток диффузной эндокринной системы, способных продуцировать пептидные гормоны и биологически активные амины, в которых экспрессия нейроэндокринных маркеров (НЭМ) выявляется более чем в 50 % клеток всей клеточной популяции.
Диагностика НЭО является достаточно сложной. В 12 % случаев НЭО оказываются клинически нефункционирующими, длительно существуют без характерной симптоматики и почти в 60 % случаев выявляются на стадиях, когда уже имеются отдаленные метастазы [3, 4]. При этом гормонально обусловленные (карциноидный) синдромы встречаются исключительно редко, в основном при парадоксальном повышении уровня нейроэндокринных маркеров, таких как хромогранин А, в крови. В настоящее время дискуссионными остаются вопросы о клинико-морфологических характеристиках и особенностях биологического поведения этих новообразований.
Для выявления нейроэндокринной дифференцировки опухолевых элементов применяется импрегнационный метод серебрения по Гримелиусу, в результате которого положительно окрашенными, аргирофильными, считаются только клетки с четким, зернистым, темным окрашиванием. Однако некоторые раки могут симулировать строение НЭО, при этом плотные гранулы мукопротеинов в цитоплазме трудно отличимы от нейроэндокринных гранул не только при проведении гистохимических реакций, поскольку могут давать положительную аргирофильную реакцию, но и при электронно-микроскопическом исследовании [7]. Следует отметить, что количество нейроэндокринных клеток при опухолевом росте выше, чем в норме и при гиперпластических процессах. В последние годы большое внимание уделяется различным молекулярным и клеточным маркерам, характеризующим фундаментальные биологические свойства опухоли [2, 5]. Большую значимость приобретает не морфологическое типирование, а иммуногистохимическое определение тех или иных маркеров [1, 6].
Морфофункциональный профиль молочной железы определяется наличием двух клеточных дифферонов: эпителиоклеточного и инкреторных гранулоцитов, апудоцитов (нейроэндокринных аргирофильных и хромагранин А-реактивных клеток), которые в норме располагаются между миоэпителиальными клетками и пластом эпителиальных клеток и осуществляют синтез биогенных аминов и полипептидных гормонов. Наличие различных комбинаций опухолевых производных двух дифферонов позволяет предполагать их общее происхождение из полипотентной стволовой клетки. В пользу возможности подобной двойной дифференцировки свидетельствует и наличие в опухолевых клетках НЭРМЖ рецепторов стероидных гормонов (50 % клеток в мелкоклеточных НЭРМЖ и большинство клеток при высокодифференцированных НЭРМЖ). Классификация WHO (World Health Organization Classification of Tumors) относит к НЭРМЖ только случаи с экспрессией нейроэндокринных маркеров в более чем 50 % клеточной популяции.
Первичный нейроэндокринный рак молочной железы (НЭРМЖ) – это группа НЭО редкой локализации, не имеющая значительных морфологических отличий от опухолей APUD-системы других органов, встречается в 2–5 % всех раков молочной железы, чаще в возрасте 60–70 лет [8]. Следует отметить, что до настоящего времени не существует общего соглашения о стандартах лечения НЭРМЖ. Считается, что НЭРМЖ имеют более благоприятный прогноз, чем раки молочной железы, не содержащие апудоцитов, и при обычном лечении даже низкодифференцированных мелкоклеточных НЭРМЖ безрецидивный период составляет 33–48 месяцев. В то же время прогноз НЭРМЖ во многом зависит от уровня дифференцировки опухоли. Если исключить мелкоклеточные раки, то почти 45 % этих опухолей хорошо дифференцированы, 40 % имеют умеренную дифференцировку и только 15 % – плохо дифференцированы. Продукция слизи, наличие рецепторов к эстрогену и прогестерону в нейроэндокринной опухоли являются благоприятным прогностическим признаком.
Ведущими экспертами был разработан минимальный набор универсальных данных, необходимых для морфологического заключения. Для диагностики НЭРМЖ во всем мире рекомендуют и традиционно используют панель антител: 3–4 маркера для гистологического типирования опухоли и 1 прогностический, характеризующий пролиферативную активность опухоли. Основными диагностическими ИГХ-маркерами, рекомендованными для практического применения, являются маркеры, ассоциированные с секреторными гранулами: хромогранин А (СhromА), который считается одним из наиболее характерных неспецифических маркеров нейроэндокринной дифференцировки, связанный с плотными эндокринными гранулами (LDCV), и синаптофизин (Synap) – маркер мелких везикул с нейротрансмиттерами (SLMV). Остальные маркеры, такие как CD56 (NCAM), PGP9,5 и NSE, обладают высокой чувствительностью, но не являются достаточно специфичными. В последнее время изучают новые антигены, которые являются эффективными нейроэндокринными маркерами: VMAT1 и VMAT2, NESP55, SV2. Кроме того, обязательно уточняется степень злокачественности с учетом пролиферативной активности опухолевых клеток (индекс Ki-67).
Цель исследования – провести анализ данных иммуногистохимических исследований НЭРМЖ, выполненных за период 2007–2011 гг. в лаборатории патоморфологии ФГБУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем» СО РАМН.
Материалы и методы исследования
За 5-летний период (2007–2011 гг.) проведено исследование 621 случая РМЖ у пациенток, которым выполняли оперативное лечение и/или диагностические пункционные биопсии в ГБУ РС (Я) «Якутский республиканский онкологический диспансер», 2-м хирургическом отделении и отделении общей рентгенодиагностики ГБУ РС (Я) «Республиканская больница № 1 – Национальный центр медицины», с цитологической, морфологической и иммуногистохимической верификацией диагноза.
Гистологическая обработка материала проводилась по общепринятым методикам. Использовали серийные срезы толщиной 3–5 µ. Для морфологического анализа препараты окрашивали гематоксилином и эозином.
При иммунофенотипировании клеток первичной опухоли были использованы следующие моноклональные и поликлональные антитела: PCK (PanCytokeratin 5/6/8/18 (clone 5D3fndLP34) – панцитокератин, EMA (clone GP 1.4) – эпителиально-мембранный антиген, нейроэндокринные маркеры (НЭМ): CromA (LK2H10) – хромагранин А, Synap (Polyclonal) – синаптофизин, NSE 2 (Polyclonal) – нейрон-специфическая энолаза, CD56/NCAM (clone 1213C3), Ki-67(clone MB67) (фирма-производитель «Diagnostic ByoSystems»), ER (clone 1D5) – антитела к рецепторам эстрогена, PgR (clone PgR 636) – антитела к рецепторам прогестерона (фирма-производитель «Dako»).
Демаскировка антигенных детерминант на депарафинированных, обезвоженных срезах проходила под давлением в растворе Epitop Retrieval Solution (0,01 М цитратный буфер, pH 6,0) в течение 3 минут с момента закипания. Затем срезы охлаждали 30 минут и промывали в фосфатно-солевом буфере (рН = 7,4). Срезы с первичными моно- и поликлональными антителами инкубировали 40–60 минут. Иммунное окрашивание проводилось непрямым иммунопероксидазным методом. Для визуализации антигенреактивных клеток использовали тест-системы Super Sensitive Polymer – HRP Detection System (фирма-производитель «BoiGenex») и NovoLink Polymer Detection System (фирма-производитель «Novocastra»). Срезы обрабатывали хромогенным субстратом (3,3-диаминбензидин) с последующим докрашиванием гематоксилином в течение 3 минут. Антигенпозитивные клетки идентифицировали по их коричневому ядерному, мембранному и/или цитоплазматическому окрашиванию на светооптическом уровне.
При иммунофенотипировании опухолевых клеток результаты реакций оценивали полуколичественным методом, с учетом уровня диссоциации в количестве окрашенных клеток и интенсивности окрашивания по каждому маркеру отдельно от 1 до 3 баллов. Определение уровня пролиферативной активности опухолевых клеток проводили на основе индекса Ki-67 (низкая – до 2, средняя – до 20 и высокая – более 20) как частоты окрашенных ядер при анализе 2000 опухолевых клеток в областях наибольшей пролиферативной активности.
Результаты всех исследований были занесены в специально созданную базу данных. Статистический анализ данных проводили на персональном компьютере с помощью пакета программ «Статистика для Windows» (StatSoft Inc., 1996, Version 5,0).
Результаты исследования и их обсуждение
Проведен анализ антигенных характеристик в опухолях 21 пациенток с первичным НЭРМЖ (Т2-4N0-1M0-1), что составило 3,4 % от общего числа исследований РМЖ. Средний возраст обследованных составлял 68,1 ± 6,9 лет, из них 16 (72,2 %) были старше 60 лет. Локальная стадия НЭРМЖ (T1-3N0M0) установлена в 7 случаях (33,3 %), локорегиональная стадия (T1-3N1-2M0) в 7 случаях (33,3 %). Первичная опухоль чаще локализовалась в правой молочной железе (15 больных; 71,4 %), чем в левой железе (6 больных; 28,6 %). Количество диагностированных случаев НЭРМЖ увеличилось в 2011 г. в сравнении с 2007 г. в 8 раз.
Экспрессия NSE была выявлена в 100 % наблюдений, при этом в 16 случаях (76,2 %) отмечен высокий уровень содержания антигена (2–3 балла).
Остальные маркеры встречались значительно реже: Synap – в 7 случаях (23,8 %), ChromA – в 12 случаях (57,1 %), CD56/NCAM – в 8 случаях (38,1 %). При этом наличие только NSE было установлено в 6 случаях (28,6 %). В остальных наблюдениях имелась коэкспрессия NSE c одним НЭМ в 4 случаях (19 %), с двумя НЭМ – в 5 случаях (23,8 %), и в 6 случаях выявлена коэкспрессия всех четырех НЭМ (28,6 %). Все исследованные НЭРМЖ характеризовались низкой степенью пролиферативной активности: индекс Ki-67 составил 1–2 %.
При исследовании эпителиальных маркеров PCK и EMA установлено, что экспрессия PCK в большинстве случаев отсутствовала или была слабо выражена (14 случаев; 66,7 %) и определялась в виде мозаичной и «dot-like» реакции. В то же время EMA регистрировалась чаще (16 случаев; 76,2 %) и была более выраженной и мономорфной.
Исследование рецепторов стероидных гормонов ER и PgR показало, что в 12 случаях (57,1 %) опухолевые клетки имели рецепторы обоих гормонов.
Приводим описание двух собственных наблюдений.
Пациентка Д., 54 года. Опухоль диаметром 3,5 см в виде четко ограниченного узла округлой формы, плотно-эластичной консистенции, локализовалась в нижнем внутреннем квадранте левой молочной железы. Проведена диагностическая пункционная биопсия. При гистологическом исследовании опухоль была представлена полями солидного роста лимфоцитоподобных, относительно мономорфных клеток с гиперхромными ядрами с различным содержанием хроматина, узкой цитоплазмой. Клеточные поля были пронизаны тонкостенными синусоидными сосудами с образованием перицитарных структур типа псевдорозеток. При проведении ИГХ исследования опухолевые клетки экспрессировали виментин (Vim), эпителиально-мембранный антиген (EMA), с гиперэкспрессией маркера нейроэктодермальной ткани (S100), нейронспецифической энолазы (NSE) при негативной реакции к панцитокератину (PanCK). В цитоплазме опухолевых клеток выявлена экспрессия нейроэндокринных маркеров: хромагранина (ChromA) и синаптофизина (Synap) в виде пылевидного и мелкозернистого цитоплазматического окрашивания во всех опухолевых клетках. Поставленный патоморфологический диагноз «Нейроэндокринный мелкоклеточный рак молочной железы (ICD-O codes 8041/3)» был подтвержден при морфологическом и повторном ИГХ исследовании удаленной молочной железы. При этом установлено отсутствие в опухолевых клетках рецепторов стероидных гормонов – эстрогена (ER) и прогестерона (PgR).
Пациентка В., 68 лет. Опухоль размерами 4,0×3,0×2,5 см, каменистой плотности, с нечеткой, фестончатой границей, локализовалась в верхне-наружном квадранте правой молочной железы. При гистологическом исследовании опухоль представлена полями гиперхромных, округлых клеток небольших размеров, с узкой цитоплазмой, разделенных между собой прослойками фиброзной ткани, растущих в виде солидных клеточных комплексов округлой и неправильной формы, с розеткоподобными структурами. В периферических отделах имеется инфильтрирующий рост в виде трабекул и тяжей, местами напоминающими скирр. ИГХ исследование выявило гиперэкспрессию всеми опухолевыми клетками следующих антител: Vim, EMA, S100, NSE, а также примерно в 10 % клеток PanCK. Выявлена цитоплазматическая экспрессия большинством клеток опухоли только синаптофизина (Synap) при негативной реакции на хромагранин А (ChromA). В отличие от первого случая, большинство опухолевых клеток были ER- и PgR-позитивными. Патоморфологический диагноз «Нейроэндокринный мелкоклеточный рак молочной железы (ICD-O codes 8041/3)».
Заключение
В результате проведенного морфологического и иммуногистохимического исследования установлено увеличение частоты диагностики НЭРМЖ за 5 лет наблюдения в 8 раз, что находится в соответствии с современными данными литературы [8, 9]. НЭРМЖ встречается в 3,4 % всех раков молочной железы и достоверно чаще у женщин в возрасте старше 60 лет. Анализ полученных данных свидетельствует, что НЭРМЖ при различной локализации, макроскопической картине и ИГХ профиле панцитокератинов и стероидных гормонов имеет четко выраженную экспрессию нейроэктодермальных и нейроэндокринных маркеров в различной комбинации, с высокой специфичностью NSE (100 %) и ChromA (57,1 %).
Таким образом, рак молочной железы является гетерогенным заболеванием, которое существенно различается по клиническому течению, морфологическому и молекулярному строению опухолевых элементов, что требует различных подходов к его диагностике с оптимизацией клинико-морфологического исследования и проведением иммуногистохимической верификации. НЭРМЖ образуют редкую и гетерогенную группу опухолей. ИГХ исследование выявляет гормонсекретирующие элементы и их долю в опухолевом пуле и позволяет дифференцировать НЭРМЖ от других форм рака молочной железы, в том числе и при исследовании пункционного биоптата.
Рецензенты:
Авдалян А.М., д.м.н., заведующий лабораторией молекулярной диагностики Алтайского филиала ФГБУ Российского онкологического научного центра имени Н.Н. Блохина РАМН, г. Барнаул;
Горчаков В.Н., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией функциональной морфологии лимфатической системы, ФГБУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 07.07.2014.