Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Основу неспецифической реакции организма на травматическое повреждение вещества спинного мозга составляет инициация экспрессии различных цитокинов, определяющих направленность и интенсивность тканевого метаболизма, активацию механизмов апоптоза, выраженность локальной и системной воспалительной реакции, формирование и регуляцию иммунного ответа, а также состоятельность процессов ремоделирования поврежденной нервной ткани. Данные процессы реализуются за счет аутокринных, паракринных, эндокринных гуморальных межклеточных и межсистемных взаимодействий интерлейкинов, факторов некроза опухолей, хемокинов, интерферонов, колониестимулирующих и ростовых факторов, которые определяют функциональную активность отдельных клеток (нейронов, астроцитарной глии) в зоне, окружающей первичный травматический очаг, их способность к пролиферации и дифференцировке, а также выживаемость или программируемую гибель. Эти факторы определяют конечный объем повреждения спинного мозга и возможность последующей внутриклеточной регенерации выживших нейронов или интенсивность неонейрогенеза [1, 3, 8].

Острый период травматической болезни спинного мозга характеризуется гиперпродукцией как паренхиматозной микроглии, локализованной вдоль участка повреждения, так и провоспалительных цитокинов, за которой следует выработка различных подсемейств нейроспецифических белков – нейротрофинов, цилиарных нейротрофических факторов, нейропоэтических цитокинов и других факторов роста нервной ткани. Так, интерлейкины IL-1β, IL-6, индуцируя астроцитами экспрессию факторов роста нервов, цилиарного нейротрофического фактора, способствуют внутриклеточной регенерации нервной ткани. Представители суперсемейства факторов некроза опухоли регулируют ремиелинизацию аксонов посредством активации специфических высокоаффинных мембраносвязанных или растворимых рецепторов [2, 5, 10].

Активация провоспалительных цитокинов в остром периоде травматической болезни спинного мозга также сопровождается одновременным увеличением синтеза их антагонистов – противовоспалительных интерлейкинов 4, 10, которые способствуют выживанию нейронов и глии в зоне так называемой «пенумбры» за счет ингибирования локальной (органной) воспалительной реакции и инициации продукции факторов роста нервной ткани [4, 6].

Патогенетически значимый цитокиновый дисбаланс, развивающийся при травматической болезни спинного мозга, ведет к ее прогрессированию за счет формирования множества новых «цитокиновых каскадов», определяющих амплификацию и пролонгирование эффектов цитокинов и включение так называемых «порочных кругов», ведущих к возникновению множественной органной дисфункции/недостаточности и системных осложнений [7, 9].

В этой связи определение корреляционных взаимоотношений содержания плазматических нейроспецифических белков и цитокинов у больных с осложненными повреждениями позвоночника позволяет вскрыть новые механизмы пато- и саногенеза травматической болезни спинного мозга.

Цель – на основании сопоставительного анализа содержания нейроспецифических белков, про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови пациентов с осложненными повреждениями шейного отдела позвоночника выявить новые и значимые в пато- и саногенезе корреляции, характеризующие ремоделирование нервной ткани в посттравматическом периоде.

Материал и методы исследования

Объектом исследования явились 40 пациентов обоего пола в возрасте 24 ± 7,5 лет с осложненными травматическими повреждениями шейного отдела позвоночника, находившихся в клинике нейрохирургии ФГБУ «СарНИИТО» Минздрава России в период с 2011 по 2013 гг. Все пациенты поступили в стационар в течение 1-4 суток с момента получения травмы и были сопоставимы по механизму повреждений и степени выраженности неврологического дефицита (класс А, В по шкале Frankel). Контрольную группу составили 40 условно здоровых лиц, также сопоставимых по полу и возрасту.

В обеих группах обследованных в утренние часы и натощак при пункции локтевой вены осуществляли взятие проб крови в объеме 5 мл. Кровь оставляли для свертывания при комнатной температуре, центрифугировали при 2000 оборотах/мин в течение 10 минут для получения сыворотки. Методом иммуноферментного анализа изучали количественное содержание в сыворотке крови нейроспецифических белков – фосфорилированного нейрофиламента-Н (pNF-H, пг/мл), антител к миелин-ассоциированному гликопротеину (anti-MAG, титр антител) (Buhlmann, Switzerland), основного белка миелина (MBP, нг/мл) (BioVendor, Crech Republic), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF, пг/мл) (R and D Systems USA and Canada), нейротрофина-3 (NT-3, пг/мл), нейротрофина-4/5 (NT-4, пг/мл) (Ray Bio Human) и цитокинов – фактора некроза опухоли (TNFα, пг/мл), интерлейкина 1β (IL-1β, пг/мл), интерлейкина 6 (IL-6, пг/мл), интерлейкина 4 (IL-4, пг/мл), интерлейкина 10 (IL-10, пг/мл) (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск, РФ). Исследования нейроспецифических белков и цитокинов в сыворотке крови в исследуемой группе осуществляли на 1-4-е, 7-е, 14-е, 21-е и 30-е сутки с момента получения травмы, в контрольной группе – однократно.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакета программ IBM SPSS 20 Statistics. Проверяли гипотезы о виде распределений (критерий Шапиро – Уилкса). Большинство наших данных не соответствовало закону нормального распределения, поэтому для сравнения значений использовали непараметрические критерии (U-критерий Манна – Уитни). Сопоставительный анализ статистически значимых показателей проводили с помощью определения коэффициента корреляции рангов Спирмена (R). Рассчитывали показатель достоверности (р), который определяли как статистически значимый при значениях р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

У больных с осложненной травмой шейного отдела позвоночника в остром и раннем периодах травматической болезни нами были выявлены отдельные статистически достоверные корреляции между содержанием в сыворотке крови нейроспецифических белков – маркеров альтерации нервной ткани и цитокинов (табл. 1).

Сопоставительный анализ уровня pNF-H на 1–4-е сутки с момента получения травмы свидетельствовал о наличии сильной положительной корреляции с концентрациями TNFα (р < 0,05) и IL-4 (р < 0,05). На 7-е сутки уровень pNF-H со средней силой положительно коррелировал с IL-1β (р < 0,05). На 14-е сутки фиксировали появление средней силы положительной связи между содержанием pNF-H и TNFα (р < 0,05), IL-1β (р < 0,05). На 21-е сутки обнаруживали средней силы положительные корреляции pNF-H с IL-6 (р < 0,05) и IL-10 (р < 0,05). На 30-е сутки была выявлена средней силы положительная связь между концентрациями pNF-H и IL-10 (р < 0,05).

Изучение взаимосвязи между титром анти-MAG и содержанием цитокинов свидетельствовало о появлении на 7-е сутки после травмы положительной средней силы корреляции анти-MAG с TNFα (р < 0,05), которая также сохранялась на 14-е (р < 0,05) и 21-е сутки (р < 0,05). Положительная средней силы корреляция обнаруживалась между анти-MAG и IL-1β на 14-е (р < 0,05) и 21-е сутки (р < 0,05), сила которой становилась слабой к 30-м суткам с момента травмы (р < 0,05). На 21-е (р < 0,05) и 30-е сутки (р < 0,05) возникала сильная положительная связь между концентрациями анти-MAG и IL-6, а также слабая положительная корреляция между анти-MAG и IL-4 (р < 0,05).

Таблица 1

Корреляции маркеров альтерации нервной ткани и провоспалительных цитокинов при травматической болезни спинного мозга

Примечание: «+» – положительная корреляция; «–» – отрицательная корреляция.

Анализ корреляций содержания МВР показал наличие на 1-4-е сутки положительных средней силы связи с TNFα (р < 0,05) и IL-10 (р < 0,05), слабой силы – с IL-1β (р < 0,05) и IL-4 (р < 0,05). На 7-е сутки уровень МВР слабо положительно коррелировал с TNFα (р < 0,05) и IL-1β (р < 0,05). На 14-е сутки появилась слабая отрицательная корреляция МВР и IL-6 (р < 0,05) и средняя положительная – с IL-4 (р < 0,05). На 21-е сутки после травмы отмечали появление средней силы отрицательной связи между содержанием МВР и IL-6 и средней силы положительной связи с IL-4 и IL-10 (р < 0,05), которые сохранялись и на 30-е сутки (р < 0,05).

Изучение у больных с осложненной травмой шейного отдела позвоночника острый и ранний периоды травматической болезни содержания нейроспецифических белков – маркеров регенерации нервной ткани и цитокинов также позволило нам выявить отдельные значимые взаимосвязи между ними (табл. 2).

Корреляционный анализ содержания CNTF в сыворотке крови на 1–4-е сутки после получения травмы свидетельствовал о возникновении слабой положительной связи с IL-4 (р < 0,05) и средней положительной – с IL-10 (р < 0,05). В этот же период отмечали образование положительной корреляции: сильной – с TNFα (р < 0,05), средней – с IL-6 (р < 0,05) и слабой – с IL-1β (р < 0,05). На 7-е сутки корреляции CNTF с TNFα становились слабыми (р < 0,05), однако характер связей не изменялся. 14-е сутки после травмы характеризовались появлением средней положительной связи содержания CNTF с IL-4 (р < 0,05) и IL-10 (р < 0,05). В эти же сроки фиксировали средней силы положительную корреляцию исследуемого показателя с TNFα (р < 0,05) и IL-1β (р < 0,05) и слабую – с IL-6 (р < 0,05).

Анализ взаимосвязи NT-3 с уровнями цитокинов обнаруживал на 1–4-е сутки сильную положительную корреляцию NT-3 с IL-4 (р < 0,05), IL-10 (р < 0,05). На 7-е сутки содержание NT-3 со средней силой положительно коррелировало с IL-4 (р < 0,05) и IL-10 (р < 0,05). На 14-е сутки посттравматический период характеризовался появлением множества положительных корреляций, а именно сильной с IL-4 (р < 0,05), средней силы – с IL-1β, 6 и 10 (р < 0,05) и слабой – с TNFα (р < 0,05). На 21-е и 30-е сутки концентрация NT-3 со средней силой положительно коррелировала с уровнем IL-10 (р < 0,05).

Таблица 2

Корреляции маркеров регенерации нервной ткани и противовоспалительных цитокинов при травматической болезни спинного мозга

Примечание. «+» – положительная корреляция; «–» – отрицательная корреляция.

Исследование взаимосвязи NT-4 показало лишь формирование положительной корреляции средней силы на 1–4-е сутки с IL-10 (р < 0,05). В остальные сроки наблюдения статистически достоверных корреляций NT-4 с цитокинами выявлено не было.

Согласно современным представлениям, процессы ремоделирования спинного мозга в посттравматическом периоде характеризуются усилением экспрессии разнообразных нейроспецифических белков и цитокинов, которые оказывают стимулирующее или угнетающее влияние на структуру и функционирование вторично поврежденных нейронов и клеток глии. При этом формируются новые временные регулирующие рецептор-опосредованные взаимодействия различных цитокинов, изучение хронометража которых позволяет оценивать преобладание в каждый момент времени механизмов альтерации или регенерации нервной ткани, что определяет возможности ее ремоделирования в посттравматическом периоде [1, 3].

Проведенный сопоставительный анализ содержания иммунологических маркеров ремоделирования нервной ткани и цитокинового профиля в сыворотке крови показал наличие отдельных разного характера и силы корреляций между ними.

В условиях альтерации нервной ткани в сроки с 1-х по 14-е сутки после травмы нами было обнаружено инициирующее влияние высвобождаемых в системный кровоток pNF-H и МВР на продукцию макрофагальной нейроглией TNFα. Это, по нашему мнению, может быть обусловлено массовой гибелью нейронов при первичном повреждении вещества спинного мозга, фрагменты и содержимое которых, в том числе и высвобождаемые в системный кровоток цитоплазматические нейроспецифические белки, вызывают гиперцитокинемию. Развитию последней также способствует миграция мононуклеаров в очаг повреждения и продукция ими свободных радикалов (миелопероксидазы, пероксинитрита) и хемокинов, активирующих нейроны и глиоциты на синтез цитокинов. Обнаруженная нами возрастающая корреляция pNF-H с уровнем IL-1β в сроки с 7-х по 14-е сутки с момента травмы, вероятно, связана с участием IL-1β в рекрутинге клеток иммунной системы и реализации через активацию нейроглии вторичного иммуно-воспалительного ответа. Появление отрицательных корреляций на 21–30-е сутки между pNF-H, МВР и IL-6 может свидетельствовать о дальнейшей инициации «цитокинового» каскада, направленного на процессы ремиелинизации поврежденных аксонов. Появление положительных корреляций между содержанием анти-MAG и TNFα, IL-1β, усиливающихся к 21-м суткам после получения травмы, может отражать степень выраженности повреждения вещества спинного мозга, обусловленную прогрессией локальной (органной) воспалительной реакции демиелинизацией нервных волокон. Полученные нами сведения согласуются с данными [3, 9] об инициации продукции цитокинов клетками макрофагальной нейроглии под влиянием цитоплазматических нейроспецифических белков, высвобождающихся при повреждении клеточных мембран нейронов.

Наряду с описанными корреляциями концентраций нейроспецифических белков и провоспалительных цитокинов, начиная с 21-х суток посттравматического периода, нами были обнаружены положительные взаимосвязи с противовоспалительными IL-4, 10, что мы считаем связанным с их регулирующим влиянием на выработку нейротрофических факторов, патофизиологический эффект которых направлен на повышение выживаемости сохранившихся нейронов в зоне вторичного повреждения спинного мозга. Аналогичные сведения приводятся в работах [6, 7], отражающих полифункциональные регулирующие влияния отдельных цитокинов на факторы роста нервов.

Процесс регенерации нервной ткани характеризовался двухфазными корреляциями между содержанием CNTF и уровнями про- и противовоспалительных цитокинов. Так, была зафиксирована положительная корреляция с провоспалительными цитокинами на 1–4-е и 14-е сутки. Это мы связываем с выработкой клетками макрофагальной глии TNFα, IL-1β и 6, которые потенцируют выработку астроцитами CNTF, максимально необходимого для восстановления поврежденных нейронов спинного мозга в условиях возникновения первичного и прогрессирования вторичного повреждения. Решающая роль TNFα, IL-1β и 6 в инициировании процессов ремиелинизации поврежденных нервных волокон описана в работе [3]. Аналогичное двухфазное появление на 1–4-е и 14-е сутки положительных корреляций CNTF с противовоспалительными IL-4, 10 обусловлено, по нашему мнению, с ограничением выраженности локальной воспалительной реакции, что создает оптимальные условия для выживания нейронов в зоне «пенумбры» в периоды наиболее агрессивного воздействия на них, в том числе – провоспалительных цитокинов. Однако низкие уровни содержания противовоспалительных цитокинов, а также слабые и средней силы их корреляции с CNTF отражают относительную недостаточность ограничивающих воспаление механизмов, что делает весьма затруднительными возможности внутриклеточной регенерации нейронов. Обнаруженные нами сильные и средние положительные корреляции уровней NT-3 c IL-10 во все сроки наблюдения свидетельствуют о комплексных трофных эффектах на нервную ткань. Появление слабой и средней силы положительных связей с отдельными провоспалительными цитокинами в сроки с 1-х по 14-е сутки по данным [2, 10] может быть связано с инициацией ремиелинизации поврежденных аксонов.

Выводы

1. Процессы ремоделирования спинного мозга в остром и раннем посттравматических периодах определяются комбинацией механизмов альтерации и регенерации нервной ткани, направленность и выраженность которых характеризуется динамическими изменениями соотношений нейроспецифических белков и цитокинов в сыворотке крови.

2. Содержание нейроспецифических белков в сыворотке крови при альтерации нервной ткани характеризуется преимущественным появлением отдельных преимущественно положительных корреляций с провоспалительными цитокинами; при регенерации – с противовоспалительными.

Рецензенты:

Слободской А.Б., д.м.н., профессор, заведующий отделением ортопедии ГУЗ «ОКБ», г. Саратов;

Щуковский В.В., д.м.н., профессор, ГУЗ «Перинатальный центр», г. Саратов.

Работа поступила в редакцию 29.07.2014.