Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

DEGRADATION HERBICIDES GLYPHOSATE BY BACTERIA GENERA PSEUDOMONAS AND PROTEUS

Bakulin M.K. 2 ovsyannikov y.s. 1 Tumanov A.S. 2 Bakulin V.M. 2
1 FGBOU VPO «Vyatka State Agricultcherel Academy»
2 FGBOU VPO «Vyatka State University»
In the article presented the experiment data of the perspectives of using glyphosateresistant isolates of the proteоbacteria Proteus vulgaris, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas fluorescens from agricultcherel soil polluted with phosphonates N-phosphonomethylglycin (glyphosate), in biotechnological processes of deep cultivating and degradation that xenobiotics. Proteоbacteria by Genera Proteus and Pseudomonas were shown to have the capability for biodegradation of phosphonomethylglycin and other phosphonates with the use of several pathways. Intensive study of the pathways and mechanisms of their biodegradation is required due to the abundance of herbicides glyphosate with a chemically stable carbon-phosphorus bond among xenobiotics contaminating the environment. The article illustrates that addition to the liquid media with 150-600 mcg ·sm-3 phosphonates N-phosphonomethylglycin during the Genera Pseudomonas and Proteus kind a glyphosateresistant proteоbacteria deep cultivation leads to the increase biomass synthesis level and glyphosate-destructing biotechnological process.
bacteria
biodegradation
glyphosate
xenobiotics
deep cultivating
1. Bakulin V.M. Vydelenie bakterij roda Pseudomonas iz pochvy, zagrjaznennoj ksenobiotikom fosfonometilglicinom / V.M. Bakulin, E.A. Martinson, M.K. Bakulin, N.S. Mjachina, Ju.S. Ovsjannikov // Veterinar-naja medicina. 2012, no. 1. рр. 9–11.
2. Bakulin M.K. Intensifikacija biodegradacii nefti i nefte-produktov pod vlijaniem perftordekalina // Prikl. biohimija i mikrobiologija. 2004, T. 40, no. 3. рр. 317–322.
3. Bakulin M.K. Vlijanie perftordekalina i karbogala na rost mikroorganizmov-neftedestruktorov v associacii s azotobakterom na zhid-koj sinteticheskoj srede s neft’ju / M.K. Bakulin, A.Ju. Pletneva, A.S. Grud-cyna, L.V. Bakulina // Biotehnologija. 2006, no. 6. рр. 44–50.
4. Vinogradskij S.N. Mikrobiologija pochvy // M.: Izd-vo AN SSSR, 1952. 370 р.
5. Efremenko E.N. Jekologicheski bezopasnaja biodegradacija reak-cionnyh mass, obrazujushhihsja pri unichtozhenii fosfororganicheskih otrav-ljajushhih veshhestv // E.N. Efremenko, N.V. Zav’jalova, D.A. Gudkov, I.V. Ljagin i dr. // Ros. him. zh. (Zh. Ros. him. ob-va im. D.I. Mendeleeva). 2010,T.54, no. 4. рр. 19–24.
6. Zharikov M.G. Izuchenie vlijanija glifosatsoderzhashhih gerbici-dov na agrocenoz / M.G. Zharikov, Ju.Ja. Spiridonov // Agrohimija. 2008. no. 8. рр. 81–89.
7. Zvjagincev D.G. Biololgija pochv / D.G. Zvjagincev, I.P. Bab’eva, G.M. Zenova // M.: Izd-vo MGU, 2005. 445 р.
8. Kononova S.V. Fosfonaty i ih degradacija mikroorganizma-mi / S.V. Kononova, M.A. Nesmejanova // Biohimija. 2002, T. 67, Vyp. 2, no. 6. рр. 220–233.
9. Kuznecova E.M. Glifosat: povedenie v okruzhajushhej srede i urovni ostatkov / E. M. Kuznecova, V.D. Chmil’ // Sovremennye problemy toksikologii. 2010, no. 1. рр. 87–95.
10. Klisenko M.A. Metody opredelenija mikrokolichestv pesti-cidov v produktah pitanija, kormah i vneshnej srede. Spravochnik v 2 t // M.A. Klisenko, A.A. Kalinina, G.A. Hol’kova // M.: Kolos, 1992. T 1. 567 р.
11. LAHEMA, Brno, Cheshskaja Respublika: diagnos-tics@lachema.cz,http: //www.lachema.cz.
12. Pesticide Fact Handbook: US EPA. Noyes Data Corporation. Park Ridge, New Jersey, 1990. Vol. 2. рр. 301–312.
13. Evans, C.G.T. Methods in Microbiology // C.G.T. Evans, D. Herbert, D. Tempest // 1970. рр. 277–327.

Синтетические фосфонаты являются основой многих ксенобиотиков и широко распространены среди химических веществ антропогенного происхождения, среди которых: отравляющие вещества, создаваемые в качестве химического оружия – VX, зарин и зоман; гербицид глифосат (фосфонометилглицин); производные этил- и фенилфосфонатов, используемые как инсектициды; алафосфалин и фосфономицин (бисфосфонаты) – антибиотики; циклические эфиры ароматических бисфосфонатов – полимерные добавки; фирол 76 – пламягаситель, полиаминополифосфоновые кислоты – ингибиторы коррозии [1–3].

Однако наиболее широко используемым в мире фосфонатом является гербицид системного действия глифосат, который служит основой более трех десятков препаратов, выпускаемых под разными фирменными названиями и потребляемых в больших количествах (только в США ежегодно применяется около – 22000 т этого гербицида, производимого известными фирмами «Монсанто», «Дау Агро Сайэнс» и др., в Украине – 1500 т) [цит. по 4]. Использование биологических методов утилизации токсичных фосфонатов, к которым относится и глифосат, отходов их производства и продуктов разложения, рассматривается российскими и зарубежными специалистами в качестве главной альтернативы физическим и химическим методам защиты окружающей среды от токсикантов этого типа [1, 2].

В этом плане актуальными являются исследования, проводимые вятскими биотехнологами и микробиологами (ВятГУ и ВГСА) и по созданию биологических консорциумов на основе штаммов-биодеструкторов, разработке новых биотехнологических подходов комплексного использования их для уничтожения ксенобиотиков, в том числе фосфонатов, в природных и искусственных средах [5–7].

Практический интерес представляет использование глифосатустойчивых изолятов протеобактерий, выделенных из почвы в местах интенсивного использования глифосата, в биотехнологии деградации фосфонометилглицина.

Целью настоящей работы являлась сравнительная оценка эффективности разложения глифосата почвенными изолятами протеобактерий.

Материалы и методы исследования

Для тестирования чувствительности псевдомонад к глифосату использовали препарат Раундап («Монсанто», США), содержащий 36 % глифосата.

Изоляты микроорганизмов. В работе использованы вновь выделенные изоляты протеобактерий Proteus vulgaris, Pseudomonas alcaligenes и ранее выделенный изолят P. fluorescens с типичными родовыми и видовыми свойствами, в качестве контролей – ранее описанные изоляты бактерий, выделенные сотрудниками ВятГУ [5, 6].

Питательные среды. Для выращивания микроорганизмов использовали плотную питательную среду, содержащую: картофельный крахмал - 1,0 %; соевую муку - 3,0 %; (NH4)2C4H4O6 - 0,6 %; (NH4)2S04 - 0,4 %; СаСО3, - 0,8 %; К2НРО4 - 0,01 %; глюкозы - 2,0 %; агара - 2 %, воды водопроводной до 100 % и жидкую среду того же состава - без агара «соевая среда». Для стерилизации сред и почв использовали их автоклавирование при 121 °С в течение 1 часа.

Микробиологические методы

Количественный анализ содержания глифосата в почве и других исследуемых средах определяли методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе Shimadzu – QP 2010 с масс-селективным детектором (химическая ионизация) с использованием в качестве контроля растворов коммерческого препарата Раундап («Монсанто», США). Ионизирующее напряжение – 70 э.в., температура источника ионов 200 ºС, в диапазоне массовых чисел 39–520 а.е.м. Хроматографическое разделение производных глифосата проводили на кварцевой капиллярной колонке с фазой Eqity («Supelco», CША) при температуре от 120 до 290 ºС. Температура инжектора составляла 270 ºС. Масс-спектрометрией с химической ионизацией подтверждали молекулярную массу глифосата. В качестве газа-реагента использовали метан особой чистоты (99,9995 %). Предел обнаружения метода для глифосата в исследуемых средах составлял 5 нг∙см–3. Для приготовления растворов, используемых в соответствии с инструкцией к хроматографу, при получении экстрактов из сред и приготовления подвижной фазы использовали реактивы квалификации «ХЧ».

Определение групповой принадлежности почвенных микроорганизмов, определение обсемененности и выделение чистых микробных культур проводили общепринятыми методами [8–12].

В качестве посевного материала использовали двухсуточные культуры бактерий, выращенные на плотной среде при температуре 24–28 °С. Культуры, выросшие на плотной среде, смывали физиологическим раствором и разводили до концентрации 1,5·109 бактерий в см3.

В колбы Эрленмейера объемом 500 вносили по 62,5; 250,0 и 1000,0 мкл препарата Раундап (22,5; 90,0 и 360,0 мг глифосата), затем готовой жидкой средой доводили объем рабочей смеси в колбах до 140 см3 и вносили по 10,0 см3 исследуемых посевных культур. Конечная концентрация бактерий в среде при посеве составляла 1,0·108 протеобактерий в см3, глифосата – 150 и 600 мкг·см–3. Выращивание вели при температуре 24–28 °С на шуттеле со скоростью вращения платформы 250 об/мин. Через 24 ч культивирования проводили определение количества живых бактерий в средах путем высева серийных разведений на плотные среды. Родовую и видовую принадлежность выделяемых получаемых микробных культур проводили с использованием идентификационных тест-систем (наборов) МИКРО-ЛА-ТЕСТ, производства PLIVA – Lachema (Чехия) и прилагаемых к ним Code book [12].

Результаты исследования и их обсуждение

Культуры протеобактерий Proteus vulgaris, Pseudomonas alcaligenes были выделены и идентифицированы при исследовании микробной обсемененности проб почвы, отобранных на участках сельхозугодий в Оричевском и Нововятском районах Кировской области, которые многократно подвергались воздействию глифосата [5]. При каждой обработке методом распыления расход на 100 м2 поля, предназначенного под посев овощных культур и картофеля, в среднем составлял 5 литров водного раствора, содержащего 65–70 мл 36 % глифосата.

В августе 2013 г. было отобрано четыре группы образцов почвы по 5 проб в каждой: 1 группа – образцы почвы, не обрабатываемой ранее гербицидами (контроль почвы перед обработкой глифосатом); 2 группа – образцы почвы, обработанной однократно в июле 2013 г., с последней обработки до взятия пробы прошел один месяц; 3 группа – образцы почвы, обработанной 11 раз в предшествующие пять лет (2008–2012 гг.) в весенне-летний период, при этом с последней обработки прошел год; 4 группа – пробы почвы, обработанной 11 раз в предшествующие пять лет (2008–2012 гг.) в весенне-летний период и дополнительно – однократно в июле 2013 г., с последней обработки до взятия проб прошел один месяц.

Результаты анализов свидетельствовали, что общее количество микроорганизмов менялось в зависимости от количества обработок гербицидом, так, в 1 группе (контрольной) образцов почвы средняя численность микроорганизмов составляла 8·105 КОЕ·г–1, в 2–4 группах 5·102; 9·104; 2·104 КОЕ·г–1 соответственно (рис. 1).

Полученные результаты свидетельствуют, что обработка гербицидом почвы приводит к резкому снижению плотности микроорганизмов в ней. Через месяц после однократной обработки глифосатом количество микроорганизмов в исследуемых образцах почвы было меньше в 1600 раз в сравнении с контрольными. Через год после многократной (11 раз в течение 5 лет) обработки гербицидом содержание микроорганизмов в почве в значительной степени восстановилось, но было ниже, чем в контроле, примерно в 8,9 раза. В этом случае, по-видимому, сказывалось накопление глифосата и продуктов его разложения в почве.

pic_55.wmf

Рис. 1. Содержание общего количества микроорганизмов (log колониеобразующих единиц – log КОЕ) в 1 г проб почвы: 1 – не подвергавшейся воздействию глифосата (контроль до воздействия гербицидом); 2 – обработанной однократно в июле 2013 г., за месяц до отбора и анализа проб; 3 – подвергавшейся воздействию глифосата 11 раз в течение предшествующих пяти лет (2008–2012 гг.); 4 – подвергавшейся воздействию фосфонометилглицина 11 раз в течение предшествующих пяти лет (2008–2012 гг.) и 1 раз в 2013 г., за месяц до отбора и анализа проб

Результаты определения общего количества микроорганизмов в четвертой группе проб показали, что микрофлора почвы, регулярно подвергавшейся обработке глифосатом, стала устойчива к повторным воздействиям гербицида и быстрее восстанавливалась. Об этом свидетельствуют результаты сравнительного анализа через месяц после обработки глифосатом образцов проб почвы, многократно подвергавшейся воздействию глифосата в предшествующие годы и первично обработанной глифосатом, среднее содержание микроорганизмов в образцах проб почвы группы 4 было в 50 раз выше, чем в образцах почвы группы 2.

В ходе исследований образцов почвы, многократно обработанных глифосатом (12 раз в течение 6 лет), были выделены и идентифицированы по 6 изолятов бактерий видов Pseudomonas alcaligenes и 4 изолята Proteus vulgaris, которые наряду с ранее выделенными [5] изолятами P. fluorescens обладали повышенной устойчивостью к токсическому действию глифосата в сравнении с контрольными лабораторными изолятами, не контактировавшими с гербицидом (табл. 1).

Таблица 1

Распределение изолятов бактерий по уровням устойчивости к глифосату

Видовая принадлежность культур бактерий

Количество изолятов (из числа выделенных), способных к росту в жидкой питательной среде с глифосатом в концентрации…, мкг·см-3

0,006

0,025

0, 1

0,4

P. alcaligenes

1

3

2

Pr. vulgaris

2

1

1

P. fluorescens*

5

2

P. alcaligenes 214**

1

Pr. vulgaris МС 12**

1

P. fluorescens 1457**

1

Примечания: * культуры изолятов, выделенные ранее [5];

** культуры изолятов, ранее не контактировавшие с гербицидом.

При этом 3 из вновь выделенных 10 изолятов P. alcaligenes и Pr. vulgaris (30 %) были способны к росту в жидкой среде, содержащей 0,4 мкг/см3 глифосата, 4 изолята (40 %) и 3 изолята (30 %) бактерий были способны к росту в жидкой среде, содержащей соответственно 0,1 и 0,025 мкг·см–3 фосфонометилглицина.

На основе первичных изолятов, устойчивых к 0,4 мкг·см–3 глифосата, в результате восьми пересевов культур в жидкой соевой среде с возрастающими концентрациями глифосата и отбора наиболее устойчивых клонов были выделены клоновые культуры Pr. vulgaris 3/8, P. alcaligenes5/8 и P. fluorescens 047/8 с резистентностью к 50, 110 и 250 мкг·см–3 глифосата соответственно (рис. 2).

Как видно из данных, представленных на рис. 2, при равной исходной чувствительности к глифосату нарастание устойчивости к нему у изолята псевдомонад вида P. fluorescens происходило более интенсивно, чем у изолята вида P. alcaligenes и вульгарного протея. В результате 8 пассажей на средах с возрастающими концентрациями глифосата культура P. fluorescens 047/8 повысила уровень устойчивости первичного изолята в 625 раз, в то время как культура P. alcaligenes 5/8 – в 275 раз, культура Pr. vulgaris 3/8 – в 125 раз.

pic_56.wmf

Рис. 2. Изменение уровней устойчивости бактерий в процессе восьми пассажей культур изолятов на среде с возрастающими концентрациями глифосата: 1 – P. fluorescens 047/8; 2 – P. alcaligenes5/8; 3 – Pr. vulgaris 3/8

На следующем этапе исследований, представлялось целесообразным оценить возможность использования глубинных культур полученных вариантов в процессах деструкции глифосата в лабораторных условиях глубинного культивирования и при их интродукции в контаминированную данным гербицидом почву.

При глубинном культивировании всех трех исследуемых культур и их исходных изолятов в «соевой среде» без гербицида при посевной концентрации 1,0·108 КОЕ·см–3 через сутки их концентрация составляла (4,9–6,2)·109 КОЕ·см–3 (табл. 1). Внесение в среду 150 мкг·см–3 глифосата сопровождалось снижением исходной концентрации бактерий после засева в случае культур вариантов Pr. vulgaris 3/8 и P. alcaligenes 5/8 до 0,3·106 и 0,4·108 КОЕ·см–3, при этом концентрация глифосата в среде, снижалась на 26,7–50,0 %. Культура P. fluorescens 047/8 была способна расти на среде содержащей 150 мкг·см–3 гербицида, при этом она способствовала инактивации за сутки 90 % гербицида, хотя концентрация бактерий повысилась за сутки только до 3,8·109 КОЕ·см–3, что в 1,6 раз ниже, чем в среде без глифосата. Следует отметить, что 6,7 % глифосата в контрольных средах инактивировалось без участия бактерий и при высеве исходных изолятов (табл. 2).

Таблица 2

Инактивация глифосата в жидкой «соевой среде» при глубинном культивировании протеобактерий

Микроорганизм

Концентрация глифосата в жидкой среде, мкг·см-3

Содержание живых бактерий в среде через 24 ч, КОЕ·см-3

исходная

после культивирования ( % от исходной)

P. fluorescens 047/8

0

0

6,2·109

150

15 (10,0)

3,8·109

600

200 (33,3)

0

P. fluorescens 047 (исходный изолят)

0

0

6,1·109

150

140 (93,3)

0

P. alcaligenes 5/8

0

0

4,9·109

150

75 (50,0)

0,4·108

600

450 (75)

0

P. alcaligenes 5 (исходный изолят)

0

0

4,7·109

150

140 (93,3)

0

Pr. vulgaris 3/8

0

0

5,7·109

150

110 (73,3)

0,3·106

600

510 (85,0)

0

Pr. vulgaris 3 (исходный изолят)

0

0

5,5·109

150

140 (93,3)

0

Контроль (инактивация гербицида в среде без бактериальных культур)

150

140 (93,3)

-

 

600

560 (93,3)

-

Далее был поставлен эксперимент по контаминации образцов стерильной почвы (рН 6,7) глифосатом из расчета 2400 мкг·см–3 с последующей инокуляцией в нее глубинной культуры P. alcaligenes 5/8, выращенной в «соевой среде» с 150 мкг·см–3 глифосата, до конечной концентрации в почве 1,0·108 КОЕ·см–3. В качестве контроля была использована та же почва без инокуляции микробной культуры. Уже через 5 часов после инокуляции глифосата в почве с внесенной в нее культурой P. alcaligenes 5/8 глифосат не определялся, в то время как в контрольных образцах его содержание в этот период снизилось за счет связывания частицами почвы, действия почвенных солей и других факторов только до 1200–1400 мкг·см–3.

Следует отметить, что период нормального полураспада глифосата в почве в зависимости от типа почв, как было установлено специалистами US EPA, находится составляет от 3 до 130 дней [13].

Выводы

1. В результате 8 пассажей на средах с возрастающими концентрациями глифосата получены варианты Pr. vulgaris 3/8, P. alcaligenes5/8 и P. fluorescens 047/8 с резистентностью к 50, 110 и 250 мкг·см–3 глифосата, что превышает уровни устойчивости первичных изолятов (исходных культур) в 125; 275 и 625 раз соответственно.

2. Инокуляция культуры варианта P. alcaligenes 5/8 в концентрации 1,0·108 КОЕ см–3 в стерильные образцы почвы, содержащей 2400 мкг·см–3 глифосата, привела к тому, что гербицид в почве не определялся уже через 5 часов, что свидетельствует о возможности создания с использованием данной глифосатрезистентной культуры специальных препаратов для ремедиации загрязненных этим ксенобиотиком почв.

Рецензенты:

Кузнецов С.М., д.м.н., начальник лаборатории промышленных микроорганизмов, ЗАО «Маркетинг-Бюро», г. Киров;

Погорельский И.П., д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник НИЦ ФГКУ «48 ЦНИИИ» Минобороны России, г. Киров.

Работа поступила в редакцию 28.07.2014.