Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Бакулин М.К. 2 Овсянников Ю.С. 1 Туманов А.С. 2 Бакулин В.М. 2

---

1 ФГБОУ ВПО «Вятская государственная сельскохозяйственная академия»

2 ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет»

В статье представлены экспериментальные данные, свидетельствующие о перспективности использования культур глифосатустойчивых изолятов протеобактерий Proteus vulgaris, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas fluorescens, выделенных из загрязненных фосфонатом N-фосфонометилглицином (глифосатом) почв сельскохозяйственных предприятий, в биотехнологических процессах глубинного культивирования и деградации этого ксенобиотика. Показано, что протеобактерии родов Pseudomonas и Proteus обладают способностью к биодеградации фосфонометилглицина и других фосфонатов, используя для этого несколько путей. Широкое распространение гербицида глифосата с химически стабильной углерод-фосфорной связью среди ксенобиотиков, загрязняющих окружающую среду, вызывает большой интерес к изучению путей и механизмов их биодеградации. В статье показано, что добавление глифосатрезистентных протеобактерий родов Pseudomonas и Proteus в жидкую среду с 150-600 мкг·см-3 фосфоната N-фосфонометилглицина при глубинном культивировании приводит к увеличению уровней синтеза биомассы и биотехнологического процесса деструкции глифосата.

Статья в формате PDF

416 KB

бактерии

биодеградация

глифосат

ксенобиотики

глубинное культивирование

1. Бакулин В.М. Выделение бактерий рода Pseudomonas из почвы, загрязненной ксенобиотиком фосфонометилглицином / В.М. Бакулин, Е.А. Мартинсон, М.К. Бакулин, Н.С. Мячина, Ю.С. Овсянников // Ветеринарная медицина. – 2012. – № 1. – С. 9–11.

2. Бакулин М.К. Интенсификация биодеградации нефти и нефтепродуктов под влиянием перфтордекалина // Прикл. биохимия и микробиология. – 2004. – Т. 40, № 3. – С. 317–322.

3. Бакулин М.К. Влияние перфтордекалина и карбогала на рост микроорганизмов-нефтедеструкторов в ассоциации с азотобактером на жидкой синтетической среде с нефтью / М.К. Бакулин, А.Ю. Плетнева, А.С. Грудцына, Л.В. Бакулина // Биотехнология. – 2006. – № 6. – С. 44–50.

4. Виноградский С.Н. Микробиология почвы. – М.: Изд-во АН СССР, 1952. – 370 с.

5. Ефременко Е.Н. Экологически безопасная биодеградация реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ // Е.Н. Ефременко, Н.В. Завьялова, Д.А. Гудков, И.В. Лягин и др. // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). – 2010. – Т. 54, № 4. – С. 19–24.

6. Жариков М.Г. Изучение влияния глифосатсодержащих гербицидов на агроценоз / М.Г. Жариков, Ю.Я. Спиридонов // Агрохимия. – 2008. – № 8. – С. 81–89.

7. Звягинцев Д.Г. Биология почв / Д.Г. Звягинцев, И.П. Бабьева, Г.М. Зенова. – М.: Изд-во МГУ, 2005. – 445 с.

8. Кононова С.В. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами / С.В. Кононова, М.А. Несмеянова // Биохимия. – 2002. – Т. 67, Вып. 2. – № 6. – С. 220–233.

9. Кузнецова Е.М. Глифосат: поведение в окружающей среде и уровни остатков / Е.М. Кузнецова, В.Д. Чмиль // Современные проблемы токсикологии. – 2010. – № 1. – С. 87–95.

10. Клисенко М.А. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Справочник в 2 т. // М.А. Клисенко, А.А. Калинина, Г.А. Холькова. – М.: Колос, 1992. – Т. 1. – 567 с.

11. ЛАХЕМА, Брно, Чешская Республика: [email protected],http: //www.lachema.cz.

12. Pesticide Fact Handbook: US EPA. Noyes Data Corporation // Park Ridge, New Jersey. – 1990. – Vol. 2. – P. 301–312.

13. Evans, C.G.T. Methods in Microbiology // C.G.T. Evans, D. Herbert, D. Tempest. – 1970. – P. 277–327.

Синтетические фосфонаты являются основой многих ксенобиотиков и широко распространены среди химических веществ антропогенного происхождения, среди которых: отравляющие вещества, создаваемые в качестве химического оружия – VX, зарин и зоман; гербицид глифосат (фосфонометилглицин); производные этил- и фенилфосфонатов, используемые как инсектициды; алафосфалин и фосфономицин (бисфосфонаты) – антибиотики; циклические эфиры ароматических бисфосфонатов – полимерные добавки; фирол 76 – пламягаситель, полиаминополифосфоновые кислоты – ингибиторы коррозии [1–3].

Однако наиболее широко используемым в мире фосфонатом является гербицид системного действия глифосат, который служит основой более трех десятков препаратов, выпускаемых под разными фирменными названиями и потребляемых в больших количествах (только в США ежегодно применяется около – 22000 т этого гербицида, производимого известными фирмами «Монсанто», «Дау Агро Сайэнс» и др., в Украине – 1500 т) [цит. по 4]. Использование биологических методов утилизации токсичных фосфонатов, к которым относится и глифосат, отходов их производства и продуктов разложения, рассматривается российскими и зарубежными специалистами в качестве главной альтернативы физическим и химическим методам защиты окружающей среды от токсикантов этого типа [1, 2].

В этом плане актуальными являются исследования, проводимые вятскими биотехнологами и микробиологами (ВятГУ и ВГСА) и по созданию биологических консорциумов на основе штаммов-биодеструкторов, разработке новых биотехнологических подходов комплексного использования их для уничтожения ксенобиотиков, в том числе фосфонатов, в природных и искусственных средах [5–7].

Практический интерес представляет использование глифосатустойчивых изолятов протеобактерий, выделенных из почвы в местах интенсивного использования глифосата, в биотехнологии деградации фосфонометилглицина.

Целью настоящей работы являлась сравнительная оценка эффективности разложения глифосата почвенными изолятами протеобактерий.

Материалы и методы исследования

Для тестирования чувствительности псевдомонад к глифосату использовали препарат Раундап («Монсанто», США), содержащий 36 % глифосата.

Изоляты микроорганизмов. В работе использованы вновь выделенные изоляты протеобактерий Proteus vulgaris, Pseudomonas alcaligenes и ранее выделенный изолят P. fluorescens с типичными родовыми и видовыми свойствами, в качестве контролей – ранее описанные изоляты бактерий, выделенные сотрудниками ВятГУ [5, 6].

Питательные среды. Для выращивания микроорганизмов использовали плотную питательную среду, содержащую: картофельный крахмал - 1,0 %; соевую муку - 3,0 %; (NH₄)₂C₄H₄O₆ - 0,6 %; (NH₄)₂S0₄ - 0,4 %; СаСО₃, - 0,8 %; К₂НРО₄ - 0,01 %; глюкозы - 2,0 %; агара - 2 %, воды водопроводной до 100 % и жидкую среду того же состава - без агара «соевая среда». Для стерилизации сред и почв использовали их автоклавирование при 121 °С в течение 1 часа.

Микробиологические методы

Количественный анализ содержания глифосата в почве и других исследуемых средах определяли методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе Shimadzu – QP 2010 с масс-селективным детектором (химическая ионизация) с использованием в качестве контроля растворов коммерческого препарата Раундап («Монсанто», США). Ионизирующее напряжение – 70 э.в., температура источника ионов 200 ºС, в диапазоне массовых чисел 39–520 а.е.м. Хроматографическое разделение производных глифосата проводили на кварцевой капиллярной колонке с фазой Eqity («Supelco», CША) при температуре от 120 до 290 ºС. Температура инжектора составляла 270 ºС. Масс-спектрометрией с химической ионизацией подтверждали молекулярную массу глифосата. В качестве газа-реагента использовали метан особой чистоты (99,9995 %). Предел обнаружения метода для глифосата в исследуемых средах составлял 5 нг∙см–3. Для приготовления растворов, используемых в соответствии с инструкцией к хроматографу, при получении экстрактов из сред и приготовления подвижной фазы использовали реактивы квалификации «ХЧ».

Определение групповой принадлежности почвенных микроорганизмов, определение обсемененности и выделение чистых микробных культур проводили общепринятыми методами [8–12].

В качестве посевного материала использовали двухсуточные культуры бактерий, выращенные на плотной среде при температуре 24–28 °С. Культуры, выросшие на плотной среде, смывали физиологическим раствором и разводили до концентрации 1,5·10⁹ бактерий в см3.

В колбы Эрленмейера объемом 500 вносили по 62,5; 250,0 и 1000,0 мкл препарата Раундап (22,5; 90,0 и 360,0 мг глифосата), затем готовой жидкой средой доводили объем рабочей смеси в колбах до 140 см3 и вносили по 10,0 см3 исследуемых посевных культур. Конечная концентрация бактерий в среде при посеве составляла 1,0·10⁸ протеобактерий в см3, глифосата – 150 и 600 мкг·см^–3. Выращивание вели при температуре 24–28 °С на шуттеле со скоростью вращения платформы 250 об/мин. Через 24 ч культивирования проводили определение количества живых бактерий в средах путем высева серийных разведений на плотные среды. Родовую и видовую принадлежность выделяемых получаемых микробных культур проводили с использованием идентификационных тест-систем (наборов) МИКРО-ЛА-ТЕСТ, производства PLIVA – Lachema (Чехия) и прилагаемых к ним Code book [12].

Результаты исследования и их обсуждение

Культуры протеобактерий Proteus vulgaris, Pseudomonas alcaligenes были выделены и идентифицированы при исследовании микробной обсемененности проб почвы, отобранных на участках сельхозугодий в Оричевском и Нововятском районах Кировской области, которые многократно подвергались воздействию глифосата [5]. При каждой обработке методом распыления расход на 100 м2 поля, предназначенного под посев овощных культур и картофеля, в среднем составлял 5 литров водного раствора, содержащего 65–70 мл 36 % глифосата.

В августе 2013 г. было отобрано четыре группы образцов почвы по 5 проб в каждой: 1 группа – образцы почвы, не обрабатываемой ранее гербицидами (контроль почвы перед обработкой глифосатом); 2 группа – образцы почвы, обработанной однократно в июле 2013 г., с последней обработки до взятия пробы прошел один месяц; 3 группа – образцы почвы, обработанной 11 раз в предшествующие пять лет (2008–2012 гг.) в весенне-летний период, при этом с последней обработки прошел год; 4 группа – пробы почвы, обработанной 11 раз в предшествующие пять лет (2008–2012 гг.) в весенне-летний период и дополнительно – однократно в июле 2013 г., с последней обработки до взятия проб прошел один месяц.

Результаты анализов свидетельствовали, что общее количество микроорганизмов менялось в зависимости от количества обработок гербицидом, так, в 1 группе (контрольной) образцов почвы средняя численность микроорганизмов составляла 8·10⁵ КОЕ·г^–1, в 2–4 группах 5·10²; 9·10⁴; 2·10⁴ КОЕ·г^–1 соответственно (рис. 1).

Полученные результаты свидетельствуют, что обработка гербицидом почвы приводит к резкому снижению плотности микроорганизмов в ней. Через месяц после однократной обработки глифосатом количество микроорганизмов в исследуемых образцах почвы было меньше в 1600 раз в сравнении с контрольными. Через год после многократной (11 раз в течение 5 лет) обработки гербицидом содержание микроорганизмов в почве в значительной степени восстановилось, но было ниже, чем в контроле, примерно в 8,9 раза. В этом случае, по-видимому, сказывалось накопление глифосата и продуктов его разложения в почве.

Рис. 1. Содержание общего количества микроорганизмов (log колониеобразующих единиц – log КОЕ) в 1 г проб почвы: 1 – не подвергавшейся воздействию глифосата (контроль до воздействия гербицидом); 2 – обработанной однократно в июле 2013 г., за месяц до отбора и анализа проб; 3 – подвергавшейся воздействию глифосата 11 раз в течение предшествующих пяти лет (2008–2012 гг.); 4 – подвергавшейся воздействию фосфонометилглицина 11 раз в течение предшествующих пяти лет (2008–2012 гг.) и 1 раз в 2013 г., за месяц до отбора и анализа проб

Результаты определения общего количества микроорганизмов в четвертой группе проб показали, что микрофлора почвы, регулярно подвергавшейся обработке глифосатом, стала устойчива к повторным воздействиям гербицида и быстрее восстанавливалась. Об этом свидетельствуют результаты сравнительного анализа через месяц после обработки глифосатом образцов проб почвы, многократно подвергавшейся воздействию глифосата в предшествующие годы и первично обработанной глифосатом, среднее содержание микроорганизмов в образцах проб почвы группы 4 было в 50 раз выше, чем в образцах почвы группы 2.

В ходе исследований образцов почвы, многократно обработанных глифосатом (12 раз в течение 6 лет), были выделены и идентифицированы по 6 изолятов бактерий видов Pseudomonas alcaligenes и 4 изолята Proteus vulgaris, которые наряду с ранее выделенными [5] изолятами P. fluorescens обладали повышенной устойчивостью к токсическому действию глифосата в сравнении с контрольными лабораторными изолятами, не контактировавшими с гербицидом (табл. 1).

Таблица 1

Распределение изолятов бактерий по уровням устойчивости к глифосату

Примечания: * культуры изолятов, выделенные ранее [5];

** культуры изолятов, ранее не контактировавшие с гербицидом.

При этом 3 из вновь выделенных 10 изолятов P. alcaligenes и Pr. vulgaris (30 %) были способны к росту в жидкой среде, содержащей 0,4 мкг/см3 глифосата, 4 изолята (40 %) и 3 изолята (30 %) бактерий были способны к росту в жидкой среде, содержащей соответственно 0,1 и 0,025 мкг·см^–3 фосфонометилглицина.

На основе первичных изолятов, устойчивых к 0,4 мкг·см^–3 глифосата, в результате восьми пересевов культур в жидкой соевой среде с возрастающими концентрациями глифосата и отбора наиболее устойчивых клонов были выделены клоновые культуры Pr. vulgaris 3/8, P. alcaligenes5/8 и P. fluorescens 047/8 с резистентностью к 50, 110 и 250 мкг·см^–3 глифосата соответственно (рис. 2).

Как видно из данных, представленных на рис. 2, при равной исходной чувствительности к глифосату нарастание устойчивости к нему у изолята псевдомонад вида P. fluorescens происходило более интенсивно, чем у изолята вида P. alcaligenes и вульгарного протея. В результате 8 пассажей на средах с возрастающими концентрациями глифосата культура P. fluorescens 047/8 повысила уровень устойчивости первичного изолята в 625 раз, в то время как культура P. alcaligenes 5/8 – в 275 раз, культура Pr. vulgaris 3/8 – в 125 раз.

Рис. 2. Изменение уровней устойчивости бактерий в процессе восьми пассажей культур изолятов на среде с возрастающими концентрациями глифосата: 1 – P. fluorescens 047/8; 2 – P. alcaligenes5/8; 3 – Pr. vulgaris 3/8

На следующем этапе исследований, представлялось целесообразным оценить возможность использования глубинных культур полученных вариантов в процессах деструкции глифосата в лабораторных условиях глубинного культивирования и при их интродукции в контаминированную данным гербицидом почву.

При глубинном культивировании всех трех исследуемых культур и их исходных изолятов в «соевой среде» без гербицида при посевной концентрации 1,0·10⁸ КОЕ·см^–3 через сутки их концентрация составляла (4,9–6,2)·10⁹ КОЕ·см^–3 (табл. 1). Внесение в среду 150 мкг·см^–3 глифосата сопровождалось снижением исходной концентрации бактерий после засева в случае культур вариантов Pr. vulgaris 3/8 и P. alcaligenes 5/8 до 0,3·10⁶ и 0,4·10⁸ КОЕ·см^–3, при этом концентрация глифосата в среде, снижалась на 26,7–50,0 %. Культура P. fluorescens 047/8 была способна расти на среде содержащей 150 мкг·см^–3 гербицида, при этом она способствовала инактивации за сутки 90 % гербицида, хотя концентрация бактерий повысилась за сутки только до 3,8·10⁹ КОЕ·см^–3, что в 1,6 раз ниже, чем в среде без глифосата. Следует отметить, что 6,7 % глифосата в контрольных средах инактивировалось без участия бактерий и при высеве исходных изолятов (табл. 2).

Таблица 2

Инактивация глифосата в жидкой «соевой среде» при глубинном культивировании протеобактерий

Далее был поставлен эксперимент по контаминации образцов стерильной почвы (рН 6,7) глифосатом из расчета 2400 мкг·см^–3 с последующей инокуляцией в нее глубинной культуры P. alcaligenes 5/8, выращенной в «соевой среде» с 150 мкг·см^–3 глифосата, до конечной концентрации в почве 1,0·10⁸ КОЕ·см^–3. В качестве контроля была использована та же почва без инокуляции микробной культуры. Уже через 5 часов после инокуляции глифосата в почве с внесенной в нее культурой P. alcaligenes 5/8 глифосат не определялся, в то время как в контрольных образцах его содержание в этот период снизилось за счет связывания частицами почвы, действия почвенных солей и других факторов только до 1200–1400 мкг·см^–3.

Следует отметить, что период нормального полураспада глифосата в почве в зависимости от типа почв, как было установлено специалистами US EPA, находится составляет от 3 до 130 дней [13].

Выводы

1. В результате 8 пассажей на средах с возрастающими концентрациями глифосата получены варианты Pr. vulgaris 3/8, P. alcaligenes5/8 и P. fluorescens 047/8 с резистентностью к 50, 110 и 250 мкг·см^–3 глифосата, что превышает уровни устойчивости первичных изолятов (исходных культур) в 125; 275 и 625 раз соответственно.

2. Инокуляция культуры варианта P. alcaligenes 5/8 в концентрации 1,0·10⁸ КОЕ см^–3 в стерильные образцы почвы, содержащей 2400 мкг·см^–3 глифосата, привела к тому, что гербицид в почве не определялся уже через 5 часов, что свидетельствует о возможности создания с использованием данной глифосатрезистентной культуры специальных препаратов для ремедиации загрязненных этим ксенобиотиком почв.

Рецензенты:

Кузнецов С.М., д.м.н., начальник лаборатории промышленных микроорганизмов, ЗАО «Маркетинг-Бюро», г. Киров;

Погорельский И.П., д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник НИЦ ФГКУ «48 ЦНИИИ» Минобороны России, г. Киров.

Работа поступила в редакцию 28.07.2014.

Библиографическая ссылка