Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

THE EFFECT OF EXOGENOUS DNA IN EXPERIMENTAL BREAST CANCER IN RATS WISTAR AT THE PROLIFERATIVE ACTIVITY OF HEMO- AND LYMPHOPOIETIC CELLS

Lykov A.P. 1 Bondarenko N.A. 1 Poveschenko O.V. 1 Kabakov A.V. 1 Rayter T.V. 1 Kazakov O.V. 1 Strunkin D.N. 2 Poveschenko A.F. 1 Konenkov V.I. 1
1 FSBI «Scientific institution of clinical immunology» SB RAMS
2
In addition to the traditional cytotoxic drugs with cancer, including breast cancer, use of immunomodulators. Recently introduced into medical practice the preparations on the basis of nucleic acids, in particular Panagen. However, the mechanisms of influence fragmented DNA of cell proliferative potential hemo – and lymphopoiesis studied enough. It is shown that experimental breast cancer in rats Wistar therapy fragmented DNA stimulates spontaneous level proliferation of lymphocytes, reduces the spontaneous proliferation of bone marrow cells and splenocytes. At the same time, no significant impact on the level stimulated by concanavalin A proliferation of lymphocytes, reduces the level of mitogenic response to the stimulus of bone marrow cells and splenocytes.
exogenous DNA
breast cancer
polychemotherapy
proliferation
1. Glanz S. Medical-biological statistics / М: Praktika. 1999. 459p.
2. Kudaeva O.T. Effects of preparations modifying th1/th2 ratio on the incidence of clinical variants of chronic graft-versus-host reaction / O.T. Kudaeva, E.V. Goiman, A.P. Lykov / Bull. Exp. Biol. Medic., 2005, no.9, pp. 325–327.
3. Kuligina E.S. Epidemiological and molecular aspects of breast cancer / E.S. Kuligina / Prakticheskaja onkologija, 2010, no. 4, pp. 203–216.
4. Kukharev Y.V. Relationship of the immunological parametres with neoadjuvant chemotherapy effectiveness in breast cancer patients / Y.V. Kukharev, M.N. Stakheeva, A.V. Doroshenko / Sibirskij onkologicheskij zhurnal, 2013, no. 2, pp. 50–57.
5. Masnaya N.V. The reaction of cells of hematopoietic and lymphoid organs in mice of different lines on the introduction thymusdependent antigen and cyclophosphane / N.V. Masnaya, A.A. Churin, E.Yu. Sherstoboev / Bull. Exp. Biol. Medic., 2005, no. 1, pp. 42–47.
6. Masycheva V.I. Study of hemostimulation activity of the nucleoprotein complex derived from human placenta / V.I. Masycheva, E.D. Danilenko, G.G. Shimina / Sibirskij onkologicheskij zhurnal, 2012, no. 5, pp. 34–38.
7. Stenina M.B. Perspective directions of development of drug therapy for breast cancer / M.B. Stenina / Prakticheskaja onkologija, 2002, no. 4, pp. 262–272.
8. Stenina M.B. Breast cancer: the most important scientific events and the conclusions of the last years / M.B. Stenina, M.A. Frolova / Prakticheskaja onkologija, 2011, no. 1, pp. 6–11.
9. Shoshieva A.R. Chemoprophylaxis of breast cancer in experiment / A.R. Shoshieva/ Avtoreferat Diss. Doctor of medical science, 2010, 47 p.

Побочным эффектом неоадъювантной химиотерапии при раке молочной железы (РМЖ) является развитие иммуносупрессии, что преодолевается назначением препаратов, способных активировать иммунную систему и тем самым повысить защитные механизмы организма опухоленосителя [3, 7–8]. Известно, что препараты нуклеиновых кислот, применяемые в терапии пациентов с онкологической патологией, способствуют активации как факторов неспецифической защиты организма (нейтрофилы, макрофаги, натуральные киллерные клетки), так и факторов специфической защиты организма (Т- и В-лимфоциты, дендритные клетки).

Поэтому целью исследования стало изучение влияния полихимиотерапии на параметры иммунной системы in vivo на фоне лечения фрагментированной ДНК из плаценты человека у крыс линии Wistar с РМЖ, индуцированной введением метилнитрозомочевины.

Материалы и методы исследования

Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и с соблюдением принципов Хельсинкской декларации BMA (2000). Эксперимент выполнен на 25 крысах-самках линии Wistar с массой 300–350 г. Животные содержались на стандартной лабораторной диете и имели свободный доступ к воде. РМЖ у 21 крысы линии Wistar индуцировали введением N-метил-N-нитрозомочевины (Sigma-Aldrich, США) 5 раз с интервалом в 7 дней подкожно в область одной и той же молочной железы (2-я молочная железа справа) [9]. Было сформировано 6 групп животных: 1-я группа – интактные особи (n = 4); 2-я группа – животным проведено только оперативное удаление пораженной молочной железы (n = 3); 3-я группа – животным проведено оперативное удаление пораженной молочной железы, подключена полихимиотерапия и введение фрагментированной ДНК (n = 5); 4-я группа – животным проведено оперативное удаление опухоли и проводилась полихимиотерапия (n = 5); 5-я группа – животным не удалялась опухоль молочной железы, но проводилась полихимиотерапия (n = 4). 6-ю группу составили животные, которым индуцировали РМЖ (опухоленосители), но не проводилось хирургическое вмешательство и полихимиотерапия (n = 4). Курс полихимиотерапии (ПХТ) включал в себя: 5-фторурацил (Ebewe, Австрия) из расчета 15 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии; метотрексат (Ebewe, Австрия) из расчета 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии; циклофосфан (ОАО «Биохимия», Саранск) из расчета 3 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно однократно 14 дней. Курс терапии фрагментированной ДНК (5 мг/кг) проводили внутрибрюшинным введением однократно в течение 14 дней через 3 часа после введения циклофосфана. В экспериментах использовали субстанцию препарата Панаген с содержанием фрагментированной ДНК 1,7 мг/мл. Препарат Панаген (ЛСР № 004429/08 от 09.06.08) представляет собой фрагментированный нуклеопротеидный комплекс, выделенный из плаценты человека. Оперативное лечение проводили через 6 месяцев от момента индукции РМЖ. Животных из эксперимента выводили через 6 месяцев под наркозом (40 мг/кг нембутана внутрибрюшинно; Sigma-Aldrich, США), что обусловливалось необходимостью прижизненного сбора лимфы из грудного лимфатического протока. Ядросодержащие клетки костного мозга (КМ) получали при помощи перфузии бедренных костей лабораторных животных [2]. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) от линии крыс Wistar (n = 5) получали из клеток КМ. Ядросодержащие клетки КМ ресуспендировали в среде DMEM (Биолот, СПб) и пропускали через фильтр (размер пор 80 мкм) для удаления клеточного дебриса, подсчитывали количество жизнеспособных клеток. Для получения КМ-ММСК ядросодержащие клетки КМ инкубировали в пластиковых флаконах (TPP, Швейцария) в среде DMEM (Биолот, СПб), дополненной 100 мкг/мл гентамицина сульфата (Дальхимфарм, Хабаровск), 2 мM L-глютамина (ICN, США) и 15 % FCS при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Через 48 часов неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а прилипающую фракцию клеток культивировали до получения конфлюэнтного слоя. Снятие КМ-ММСК при пассировании осуществляли с использованием 0,25 % раствора трипсина/0,02 % раствора ЭДТА (ICN, США). Суспензию спленоцитов получали измельчением селезенок от лабораторных животных [2]. Мононуклеарные клетки (МНК) из лимфы получали осаждением при 1500 об/мин в течение 5 минут с последующей 2-кратной отмывкой в ЗФР. Пролиферативный потенциал клеток КМ, спленоцитов и МНК из лимф оценивали в МТТ-тесте в присутствии и отсутствии Конканавалина А (Sigma-Aldrich, США) в дозе 10 мкг/мл оценивали спектрофотометрически (длина волны 492 нм) по включению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида – МТТ (Sigma-Aldrich, США) через 72 часа и выражали в условных единицах оптической плотности. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квартилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна – Уитни и принималась при значениях p < 0,05 [1].

Результаты исследований и их обсуждение

Представлялось важным изучить, как влияет включение экзогенной ДНК к неоадъювантной химиотерапии на функциональную активность клеток гемо- и лимфопоэза. Так, отмечено статистически значимое увеличение спонтанной пролиферативной активности МНК из лимфы в группах крыс, подвергшихся оперативному вмешательству и ПХТ, в группе, получавшей лечение фрагментированной ДНК, и в группе опухоленосителей, по сравнению с интактными животными (табл. 1). Интенсивность пролиферативного потенциала МНК в ответ на митогенный стимул была сопоставимой во всех группах, за исключением группы, подвергшейся оперативному вмешательству и дополненной ПХТ. Интегральный показатель пролиферации, выражаемый в индексе стимуляции, выявил, что его значение статистически значимо выше по сравнению с группой животных, получавших терапию фрагментированной ДНК, и группой сравнения по РМЖ.

Анализ пролиферативной активности клеток КМ в группах животных с РМЖ выявил статистически значимые различия как в спонтанном, так и митоген-стимулированном тесте (табл. 2). Так, наивысшая спонтанная пролиферативная активность отмечена в группе крыс, подвергшихся только оперативному вмешательству, и в группе опухоленосителей. В остальных экспериментальных группах спонтанный пролиферативный потенциал клеток КМ был статистически значимо ниже по сравнению с интактными животными. Аналогичная картина наблюдается и для пролиферативной активности клеток КМ при стимуляции митогеном. Клетки КМ крыс из группы, подвергшейся только удалению молочной железы, имели статистически значимо высокую пролиферацию в ответ на дополнительную стимуляцию их Конканавалином А. В то же время в остальных экспериментальных группах пролиферативный потенциал клеток КМ был статистически значимо меньшим по сравнению с аналогичным показателем для интактных животных.

Как видно из табл. 3, спонтанная пролиферативная активность спленоцитов животных из опытных групп была статистически значимо выше по сравнению с аналогичным параметром в интактной группе. Уровень спонтанной пролиферации в группе, получавшей лечение фрагментированной ДНК, был статистически значимо меньшим по сравнению с другими опытными группами, особенно с группой опухоленосителей. Аналогичная картина характерна и для пролиферативной активности спленоцитов, индуцированной митогенным стимулом.

Таблица 1

Показатели пролиферативной активности мононуклеаров из грудного лимфатического протока крыс-самок линии Wistar (Me; Lq-Hq)

Параметры

Спонтанный уровень пролиферации

Конканавалин А-индуцированный уровень пролиферации

Индекс стимуляции

Интактные (1)

0,192; 0,162-0,215

p1-3 = 0,049

p1-4 = 0,020

p1-6 = 0,043

0,240; 0,189-0,281

p1-4 = 0,021

1,25; 1,10-1,40

p1-3 = 0,049

p1-6 = 0,043

Прооперированные без ПХТ (2)

0,226; 0,212-0,294

p2-4 = 0,034

0,301; 0,251-0,312

p2-4 = 0,034

1,11; 1,06-1,42

Прооперированные ПХТ + ДНК (3)

0,267; 0,263-0,309

0,257; 0,210-0,326

p3-4 = 0,027

0,96; 0,80-1,05

Прооперированные + ПХТ (4)

0,354; 0,347-0,380

p4-5 = 0,021

p4-6 = 0,021

0,413; 0,355-0,456

p4-6 = 0,043

1,10; 1,02-1,20

ПХТ без оперативного лечения (5)

0,215; 0,204-0,278

0,300; 0,197-0,405

1,13; 0,93-1,61

Опухоленосители (6)

0,304; 0,257-0,316

0,235; 0,205-0,304

0,92; 0,73-1,05

Примечание. МНК - мононуклеарные клетки; ПХТ - полихимиотерапия; фрДНК - фрагментированная ДНК из плаценты человека; p - достоверность различий.

Таблица 2

Показатели пролиферативной активности клеток костного мозга крыс-самок линии Wistar (Me; Lq-Hq)

Исследуемые параметры

Спонтанный уровень пролиферации

Конканавалин А-индуцированный уровень пролиферации

Индекс стимуляции

Интактные (1)

0,359; 0,349-0,359

p1-2 = 0,034

p1-3 = 0,014

p1-4 = 0,021

p1-5 = 0,021

p1-6 = 0,021

0,651; 0,646-0,656

p1-2 = 0,034

p1-3 = 0,014

p1-4 = 0,021

p1-5 = 0,021

p1-6 = 0,021

1,82; 1,81-1,86

p1-2 = 0,034

p1-3 = 0,014

p1-4 = 0,021

p1-5 = 0,021

p1-6 = 0,021

Прооперированные без ПХТ (2)

0,456; 0,450-0,4604

p2-3 = 0,025

p2-4 = 0,034

p2-5 = 0,034

p2-6 = 0,034

0,799; 0,790-0,810

p2-3 = 0,025

p2-4 = 0,034

p2-5 = 0,034

p2-6 = 0,034

1,75; 1,71-1,80

p2-3 = 0,025

p2-4 = 0,034

p2-5 = 0,034

p2-6 = 0,034

Прооперированные ПХТ + ДНК (3)

0,232; 0,230-0,232

p3-4 = 0,014

p3-5 = 0,014

p3-6 = 0,014

0,437; 0,430-0,437

p3-4 = 0,014

p3-5 = 0,014

p3-6 = 0,014

1,88; 1,86-1,88

p3-4 = 0,014

p3-5 = 0,014

p3-6 = 0,014

Прооперированные + ПХТ (4)

0,133; 0,131-0,136

p4-5 = 0,021

p4-6 = 0,021

0,272; 0,267-0,285

p4-5 = 0,021

p4-6 = 0,021

2,05; 2,03-2,08

p4-5 = 0,021

p4-6 = 0,021

ПХТ без оперативного лечения (5)

0,309; 0,304-0,314

p5-6 = 0,021

0,283; 0,274-0,293

p5-6 = 0,021

0,91; 0,87-0,96

p5-6 = 0,021

Опухоленосители (6)

0,369; 0,364-0,374

0,563; 0,558-0,568

1,53; 1,50-1,54

Примечание. МНК – мононуклеарные клетки; ПХТ – полихимиотерапия; фрДНК – фрагментированная ДНК из плаценты человека; p – достоверность различий.

Таким образом, анализ функциональной активности клеток гемо- и лимфопоэза по данным пролиферативного потенциала как в спонтанном, так и митоген-стимулированном тесте выявил, что не во всех случаях терапия животных фрагментированной ДНК способствовала активации пролиферации клеток гемо- и лимфопоэза.

Таблица 3

Показатели пролиферативной активности спленоцитов крыс-самок линии Wistar (Me; Lq-Hq)

Параметры

Спонтанный уровень пролиферации

Конканавалин А-индуцированный уровень пролиферации

Индекс стимуляции

Интактные (1)

0,083; 0,070-0,107

p1-2 = 0,034

p1-3 = 0,014

p1-4 = 0,021

p1-5 = 0,021

p1-6 = 0,021

0,063; 0,057-0,074

p1-2 = 0,034

p1-3 = 0,014

p1-4 = 0,021

p1-5 = 0,021

p1-6 = 0,021

0,76; 0,69-0,81

p1-2 = 0,034

p1-3 = 0,014

p1-5 = 0,021

p1-6 = 0,021

Прооперированные без ПХТ (2)

0,400; 0,397-0,417

p2-3 = 0,025

p2-4 = 0,034

p2-5 = 0,034

p2-6 = 0,034

0,420; 0,410-0,431

p2-3 = 0,025

p2-4 = 0,034

p2-5 = 0,034

p2-6 = 0,034

1,03; 1,03-1,03

p2-3 = 0,025

p2-4 = 0,034

p2-5 = 0,034

p2-6 = 0,034

Прооперированные ПХТ + ДНК (3)

0,170; 0,160-0,170

p3-4 = 0,014

p3-5 = 0,014

p3-6 = 0,014

0,148; 0,148-0,150

p3-4 = 0,014

p3-6 = 0,014

0,87; 0,87-0,88

p3-4 = 0,014

p3-5 = 0,014

p3-6 = 0,027

Прооперированные + ПХТ (4)

0,252; 0,247-0,265

p4-5 = 0,021

p4-6 = 0,021

0,179; 0,172-0,189

p4-6 = 0,021

0,70; 0,65-0,76

p4-5 = 0,021

p4-6 = 0,021

ПХТ без оперативного лечения (5)

0,363; 0,359-0,374

p5-6 = 0,021

0,160; 0,152-0,170

p5-6 = 0,021

0,43; 0,40-0,47

p5-6 = 0,021

Опухоленосители (6)

0,790; 0,780-0,795

0,651; 0,649-0,656

0,82; 0,82-0,83

Примечание. МНК – мононуклеарные клетки; ПХТ – полихимиотерапия; фрДНК – фрагментированная ДНК из плаценты человека; p – достоверность различий.

Полученные результаты по количественному составу органов кроветворения и лимфопоэза также не противоречат литературным данным о нормализации состава периферической крови после введения цитостатических препаратов [5]. Так, нами через 2 недели после окончания курса ПХТ экспериментальным животным при РМЖ не выявлено статистически значимых различий по количеству мононуклеарных клеток в лимфе грудного протока между всеми группами животных, что указывает на тот факт, что органы гемопоэза преодолели повреждающее действие цитостатиков. Более того, транзиторная лимфопения, возникающая на фоне терапии цитостатиками, способствует появлению в организме нового пула лимфоцитов, способных эффективно оказывать цитотоксический эффект на клетки опухоли [4]. Более того, полученные данные о восстановлении пула мононуклеарных клеток в лимфе, в том числе и на фоне терапии экзогенной ДНК, согласуются с данными авторов, указывающих на стимуляцию процессов регенерации кроветворения введением чужеродной ДНК [6]. В то же время на фоне терапии фрагментированной ДНК животных с РМЖ отмечено возрастание количества спленоцитов, ядросодержащих клеток костного мозга и костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток по сравнению с контрольной группой по РМЖ. Нами не найдено литературных данных, в которых также бы исследовали количественный состав органов гемо- и лимфопоэза на фоне ПХТ и дополнительного введения экзогенной ДНК. Кроме этого, получены новые данные о функциональной активности мононуклеаров лимфы грудного протока, спленоцитов, ядросодержащих клеток костного мозга (пролиферативный потенциал, цитокинпродуцирующая активность), которые также указывают на разнонаправленное влияние фрагментированной ДНК. Так, под влиянием фрагментированной ДНК отмечено снижение пролиферативного потенциала клеток КМ и спленоцитов по сравнению с контрольной группой животных по РМЖ.

Заключение

Следовательно, исходя из изложенного, необходимо учитывать вероятность благоприятного влияния фрагментированной ДНК на пролиферативный потенциал опухолевых клеток и с осторожностью назначать его при онкопатологии.

Выражаем благодарность за техническую и организационную помощь в проведении экспериментов Алямкиной Е.А., Долговой Е.В., Рогачеву В.А. и Богачеву С.С., сотрудникам ИЦИГа.

Рецензенты:

Бгатова Н.П., д.б.н., зав. лабораторией ультраструктурных исследований, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск;

Горчаков В.Н., д.м.н., зав. лабораторией функциональной морфологии лимфатической системы, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 04.06.2014.