Высокая частота рака молочной железы и низкая эффективность традиционных методов терапии диктуют необходимость поиска новых средств неоадъювантной химиотерапии и средств, способных нивелировать побочные эффекты от такой терапии [3, 5, 7–8, 10–13]. Известно, что препараты нуклеиновых кислот, применяемые в терапии пациентов с онкологической патологией, способствуют активации как факторов неспецифической защиты организма, так и факторов специфической защиты организма [10]. Однако эффект экзогенной ДНК на гемо- и лимфопоэз при онкопатологии, в том числе и при РМЖ, изучен недостаточно.
Поэтому целью исследования стало изучение влияния полихимиотерапии на параметры иммунной системы in vivo на фоне лечения фрагментированной ДНК из плаценты человека у крыс линии Wistar с РМЖ, индуцированным введением метилнитрозомочевины.
Материалы и методы исследования
Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и с соблюдением принципов Хельсинкской декларации BMA (2000). Эксперимент выполнен на 25 крысах-самках линии Wistar с массой 300–350 г. Животные содержались на стандартной лабораторной диете и имели свободный доступ к воде. РМЖ у 21 крысы линии Wistar индуцировали введением N-метил-N-нитрозомочевины (Sigma-Aldrich, США) 5 раз с интервалом в 7 дней подкожно в область одной и той же молочной железы (2-я молочная железа справа) [9]. Было сформировано 6 групп животных: 1-я группа – интактные особи (n = 4); 2-я группа – животным проведено только оперативное удаление пораженной молочной железы (n = 3); 3-я группа – животным проведено оперативное удаление пораженной молочной железы, подключена полихимиотерапия и введение фрагментированной ДНК (n = 5); 4-я группа – животным проведено оперативное удаление опухоли и проводилась полихимиотерапия (n = 5); 5-я группа – животным не удалялась опухоль молочной железы, но проводилась полихимиотерапия (n = 4). 6-ю группу составили животные, которым индуцировали РМЖ (опухоленосители), но не проводилось хирургическое вмешательство и полихимиотерапия (n = 4). Курс полихимиотерапии (ПХТ) включал в себя: 5-фторурацил (Ebewe, Австрия) из расчета 15 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии; метотрексат (Ebewe, Австрия) из расчета 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии; циклофосфан (ОАО «Биохимия», Саранск) из расчета 3 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно однократно 14 дней. Курс терапии фрагментированной ДНК (5 мг/кг) проводили внутрибрюшинным введение однократно в течение 14 дней через 3 часа после введения циклофосфана. В экспериментах использовали субстанцию препарата Панаген с содержанием фрагментированной ДНК 1,7 мг/мл. Препарат Панаген (ЛСР № 004429/08 от 09.06.08) представляет собой фрагментированный нуклеопротеидный комплекс, выделенный из плаценты человека. Оперативное лечение проводили через 6 месяцев от момента индукции РМЖ. Животных из эксперимента выводили через 6 месяцев под наркозом (40 мг/кг нембутана внутрибрюшинно; Sigma-Aldrich, США), что обусловливалось необходимостью прижизненного сбора лимфы из грудного лимфатического протока. Ядросодержащие клетки костного мозга (КМ) получали при помощи перфузии бедренных костей лабораторных животных [2]. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) от линии крыс Wistar (n = 5) получали из клеток КМ. Ядросодержащие клетки КМ ресуспендировали в среде DMEM (Биолот, СПб) и пропускали через фильтр (размер пор 80 мкм) для удаления клеточного дебриса, подсчитывали количество жизнеспособных клеток. Для получения КМ-ММСК ядросодержащие клетки КМ инкубировали в пластиковых флаконах (TPP, Швейцария) в среде DMEM (Биолот, СПб), дополненной 100 мкг/мл гентамицина сульфата (Дальхимфарм, Хабаровск), 2 мM L-глютамина (ICN, США) и 15 % FCS при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Через 48 часов неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а прилипающую фракцию клеток культивировали до получения конфлюэнтного слоя. Снятие КМ-ММСК при пассировании осуществляли с использованием 0,25 % раствора трипсина/0,02 % раствора ЭДТА (ICN, США). Суспензию спленоцитов получали измельчением селезенки [2]. Мононуклеарные клетки (МНК) из лимфы получали осаждением при 1500 об/мин в течение 5 минут с последующей 2-кратной отмывкой в забуференном физиологическом растворе. Пролиферативный потенциал клеток КМ, спленоцитов и МНК из лимф оценивали в МТТ-тесте в присутствии и отсутствии Конканавалина А (Sigma-Aldrich, США) в дозе 10 мкг/мл оценивали спектрофотометрически (длина волны 492 нм) по включению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида – МТТ (Sigma-Aldrich, США) через 72 часа и выражали в условных единицах оптической плотности. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квартилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна – Уитни, и принималась при значениях p < 0,05 [1].
Результаты исследования и их обсуждение
В серии опытов по оценке эффективности полихимиотерапии на фоне применения фрагментированной ДНК проведен анализ репаративной способности органов кроветворения и лимфопоэза после воздействия на организм повреждающих факторов. Как видно из таблицы, статистически значимых различий по количеству МНК в лимфе между группами не выявлено, что указывает на тот факт, что прошло достаточное время для восстановления пула циркулирующих лимфоцитов.
В то же время выявлены статистически значимые различия по количеству спленоцитов, ядросодержащих клеток КМ и КМ-ММСК в исследуемых группах животных. Так, отмечено статистически значимое увеличение количества спленоцитов в группе животных, подвергшихся только оперативному лечению, в группе животных, получавших только ПХТ и комбинацию ПХТ с введением фрагментированной ДНК по сравнению с контрольной группой животных и группой сравнения по РМЖ. Однако в группе животных, подвергшихся оперативному вмешательству с проведением неоадъювантной ПХТ, отмечено статистически значимое снижение количества спленоцитов в сравнении с остальными группами животных. Что касается количества клеток КМ, то выявлено статистически значимое снижение их количества во всех экспериментальных группах животных с РМЖ по сравнению с интактными животными. В то же время наиболее выраженное подавление количества клеток в КМ отмечено в группе животных, подвергшихся оперативному вмешательству и получавших ПХТ в комбинации с фрагментированной ДНК, в группе животных, получавших только ПХТ, и в контрольной группе животных по РМЖ. По количеству КМ-ММСК в исследуемых группах также выявлены статистически значимые различия. Так, выявлен парадоксальный факт статистически значимого увеличения количества КМ-ММСК в группе животных с РМЖ, подвергшихся только оперативному вмешательству по сравнению с остальными группами животных. Не выявлено статистически значимого различия по количеству КМ-ММСК между интактными животными и группой, получавшей терапию фрагментированной ДНК. Количество КМ-ММСК в группах, подвергшихся ПХТ без оперативного вмешательства или же с оперативным вмешательством, а также в контрольной группе по РМЖ, было статистически значимо меньшим по сравнению с интактными животными и группой крыс, получавших терапию фрагментированной ДНК.
Абсолютное количество мононуклеаров, спленоцитов, клеток костного мозга и костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток у крыс-самок линии Wistar (Me; Lq-Hq)
|
Параметры |
МНК (106) |
Спленоциты (106) |
КМ (106) |
КМ-ММСК (106) |
|
Интактные (1) |
4,25; 3,87-6,12 |
287,5; 277-300 p1-2 = 0,034 p1-3 = 0,014 p1-4 = 0,021 |
207,5; 195-225 p1-2 = 0,034 p1-3 = 0,014 p1-4 = 0,021 p1-5 = 0,021 p1-6 = 0,021 |
1,25; 1,1-1,3 p1-2 = 0,032 p1-4 = 0,020 p1-5 = 0,020 p1-6 = 0,019 |
|
Прооперированные без ПХТ (2) |
8,0; 2,0-10,0 |
675; 450-675 p2-3 = 0,025 p2-4 = 0,034 p2-5 = 0,034 p2-6 = 0,034 |
160; 155-175 p2-5 = 0,034 p2-6 = 0,034 |
2,9; 2,8-3,0 p2-3 = 0,021 p2-4 = 0,032 p2-5 = 0,032 p2-6 = 0,031 |
|
Прооперированные ПХТ + фрДНК (3) |
4,4; 4,0-7,5 |
350; 350-420 p3-4 = 0,014 p3-6 = 0,014 |
135,0; 120-155 p3-5 = 0,014 p3-6 = 0,014 |
1,2; 1,05-1,2 p3-4 = 0,012 p3-5 = 0,012 p3-6 = 0,011 |
|
Прооперированные + ПХТ (4) |
6,0; 4,05-8,0 |
119; 102-136 p4-5 = 0,021 p4-6 = 0,021 |
153; 144-156,5 p4-5 = 0,021 p4-6 = 0,021 |
0,75; 0,722-0,77 p4-6 = 0,019 |
|
ПХТ без оперативного лечения (5) |
7,25; 4,75-10,75 |
350; 300-400 p5-6 = 0,021 |
87,5; 83,75-93,75 p5-6 = 0,03 |
0,75; 0,722-0,77 p5-6 = 0,019 |
|
Опухоленосители (6) |
4,0; 3,5-5,1 |
262,5; 250-275 |
68,75; 62,5-77,5 |
0,42; 0,40-0,45 |
Примечания: МНК – мононуклеарные клетки; КМ – клетки костного мозга; КМ-ММСК – костномозговые мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки; ПХТ – полихимиотерапия; фрДНК – фрагментированная ДНК из плаценты человека; p – достоверность различий.
Таким образом, с учетом времени, прошедшего после проведения различных схем лечения животных с РМЖ, выявлена различная регенеративная способность органов кроветворения и лимфопоэза. Не всегда добавление к стандартной процедуре терапии РМЖ введение фрагментированной ДНК статистически значимо улучшала показатели гемо- и лимфопоэза.
Полученные результаты по количественному составу органов кроветворения и лимфопоэза также не противоречат литературным данным о нормализации состава периферической крови после введения цитостатических препаратов [5; 13]. Так, нами через 2 недели после окончания курса ПХТ у экспериментальных животных при РМЖ не выявлено статистически значимых различий по количеству мононуклеарных клеток в лимфе грудного протока между всеми группами животных, что указывает на тот факт, что органы гемопоэза преодолели повреждающее действие цитостатиков. Более того, транзиторная лимфопения, возникающая на фоне терапии цитостатиками способствует появлению в организме нового пула лимфоцитов, способных эффективно оказывать цитотоксический эффект на клетки опухоли [4]. Кроме этого, полученные данные о восстановлении пула мононуклеарных клеток в лимфе, в том числе и на фоне терапии экзогенной ДНК, согласуются с данными авторов, указывающих на стимуляцию процессов регенерации кроветворения введением чужеродной ДНК [6]. В то же время, на фоне терапии фрагментированной ДНК животных с РМЖ отмечено возрастание количества спленоцитов, ядросодержащих клеток костного мозга и костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток по сравнению с контрольной группой по РМЖ. Нами не найдено литературных данных, в которых также бы исследовали количественный состав органов гемо- и лимфопоэза на фоне ПХТ и дополнительного введения экзогенной ДНК.
Заключение
Таким образом, терапия фрагментированной экзогенной ДНК способствует уменьшению цитопатического действия препаратов полихимиотерапии, но не способствует полному восстановлению функции органов гемо- и лимфопоэза.
Выражаем благодарность за техническую и организационную помощь в проведении экспериментов Алямкиной Е.А., Долговой Е.В., Рогачеву В.А. и Богачеву С.С., сотрудникам ИЦИГа.
Рецензенты:
Бгатова Н.П., д.б.н., зав. лабораторией ультраструктурных исследований, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск;
Горчаков В.Н., д.м.н., зав. лабораторией функциональной морфологии лимфатической системы, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 04.06.2014.