Одной из острых проблем экологии человека является снижение резистентности и нарушение адаптации к факторам внешней среды, связанное с обеднением рациона биологически активными регуляторами гомеостаза [5]. Промышленное производство микронутриентов как функциональных продуктов питания перевело решение проблемы алиментарных дисбалансов на более высокий технологический уровень. Рынок биологически активных добавок (БАД) к пище стремительно расширяется. Одним из устойчивых резидентов российского рынка (стаж 16 лет) является компания «Vision International People Group», позиционирующая свою продукцию под лозунгами «путь к здоровью» как универсальные антиоксиданты, защищающие организм от окислительного стресса [6]. Надёжных количественных критериев качества, однако, не предлагается. В то же время стихийный выбор БАД на основе коммерческой рекламы всё чаще оказывается связан с низкой или отсутствующей эффективностью препаратов, а нередко и негативными последствиями для здоровья. Таким образом, проблема контроля антиоксидантной активности БАД приобретает всё более высокую актуальность. Одним из путей решения этой проблемы является расширение возможности анализа крови как «зеркала организма» (по выражению Клода Бернара) за счёт получения информации о состоянии редокс-баланса внутренней среды организма по функциональной активности фагоцитов как уникальных радикал-продуцирующих иммунных клеток [7].
Целью настоящей работы было исследование зависимости функциональной активности фагоцитов крови, продуцирующих свободнорадикальные метаболиты, от свойств биологически активных пищевых добавок фирмы «VISION International People Group».
Материалы и методы исследования
Материалом служили биологически активные микронутриенты «VISION», содержащие комплексы антиоксидантов различных механизмов действия [6].
«Антиокс» («Antiox»): экстракт виноградных косточек (смесь биофлавоноидов: гесперитин, нарингин, рутин, кверцетин) - 150 мг; экстракт гинкго билоба («Ginkgo biloba») (гинкголиновая кислота, пиробол, кверцетин, танин, фитостерин, аспарагин, Са, Р) - 26,5 мг; витамин А - 5 мг; витамин С - 65 мг; витамин Е - 10 мг; дрожжи с селеном - 50 мг; цинк - 15 мг.
«Пакс» («Pax»): экстракты мелиссы лекарственной (Melissa officinalis) - 50 мг, лаванды лекарственной (Lavandula spica) - 50 мг, дикого мака (Papaver rocas) - 50 мг; витамин В1 - 1,15 мг; витамин В2 - 1,6 мг; витамин В6 - 2,0 мг; витамин В9 - 0,2 мг; витамин В12 - 1,0 мг; витамин Н - 0,15 мг; витамин РР - 24,0 мг; кальций - 26,0 мг; фосфор - 26,0 мг.
«ХромВитал» («Chromvital»): экстракты кола нитида (Cola nitida) (кофеин и теобромин) - 20 мг, гуараны (Guarana) (кофеин) - 72 мг, спирулины большой (Spirulina maxima) (альгинаты, протеины - 65 % от сухой массы; минеральные вещества, витамины, железо, глюконат кальция, 8 незаменимых аминокислот, РНК и ДНК) - 75 мг, элеутерококка колючего (Eleuterococcus) (гликозиды, элеутерозиды А, В, С, D, Е; флавоноиды; эфирные масла, смолы, крахмал, липиды, пектиновые вещества, свободные сахара и полисахариды) - 175 мг; дрожжи с хромом - 25 мг; витамин С - 33 м?г.
«ЛайфПак Витал» («LifePac Vital»): b-каротин - 2,5 м?, г, витамин В1 - 1,15 мг; витамин В2 - 1,6 мг; витамин В6 - 1,7 мг; витамин В9 - 0,2 мг; витамин В12 - 1,0 мг; витамин С - 66 мг; витамин D3 - 5,0 мг; витамин E - 10,0 мг; витамин Н - 0,15 мг; витамин РР - 24,0 мг.
«ЛайфПак Юниор» («LifePac Junior»): витаминная основа та же, что и в предыдущем препарате, кроме того, микроэлементы: Fe - 0,03 мг; Mn - 0,10 мг; Cu - 50 мкг; Se - 1,25 мкг; Zn - 0,375 мг; P - 2,50 мг; Mg - 0,92 мг; Ca - 3 мг.
В работе использовали метод люминол-зависимой латекс-стимулированной хемилюминесценции по Tono-Oka [7]. Измерения проводили на РС-управляемом 36-канальном хемилюминометре БХЛ-3604, работающем в режиме счёта квантов света (СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН). Для проведения анализа in vitro получали образцы неразделённой крови или суспензию нейтрофилов по методике [3] от 20-ти практически здоровых людей 25–48 лет с заранее установленным нормореактивным (n = 10) или гиперактивным (n = 10) типом функциональной активности фагоцитов. Кроме того, использовали 10 образцов периферической крови, полученной от здоровых детей-кадет (мальчики 9–13 лет) в ходе углублённых медицинских осмотров. Для суспендирования крови и получения растворов препаратов (1 мг/мл) использовали неокрашенную среду Хенкса. Рабочую концентрацию препаратов рассчитывали исходя из рекомендуемой дозы перорального приёма с учётом 50 %-й биодоступности. Биологической моделью для тестирования радикалотропных свойств препаратов служила реакционная смесь, содержащая 100 мкл разбавленной крови (1:10), полученной от 200 мкл люминола (Sigma) в концентрации 2,2·10–4 М, 100 мкл латекса с концентрацией частиц 5·108 мл–1 (ВНИИСК, Санкт-Петербург), опсонизированный белками сыворотки крови от десяти здоровых доноров. При проведении анализа к реакционной смеси добавляли 50 мкл тестируемого препарата или физраствора (контроль). Запись кинетики продолжали 90 минут. Кинетограммы анализировали по параметрам светосуммы (S, млн имп.), высоте пика (I, имп./с) и времени его достижения (Тmax, мин). Эталоном служила стандартная ХЛ-кинетограмма, полученная с использованием микрообразцов крови 70-ти клинически здоровых людей по результатам углублённых профилактических осмотров [2]. Выводы о достоверности отличий полученных показателей кинетограмм от референтных параметров осуществляли на основании параметров вариационной статистики, оценка которых осуществлялась автоматически во время записи кинетики генерации АФК. Оценку межвыборочных различий осуществляли на основе параметрического t-критерия Стьюдента, гипотезу о соответствии нормальному распределению генеральной совокупности данных проверяли с использованием критерия Пирсона.
Результаты исследования и их обсуждение
На рис. 1 показано влияние биопрепарата «Pax» на активированный ХЛ-ответ (ХЛа) фагоцитов, продуцирующих избыточное количество АФК при активации «дыхательного взрыва» у нормореактивных (НР) и гиперактивных (ГР) фагоцитов. Из рисунка видно, что достоверное снижение светосуммы за время наблюдения под влиянием препарата «Pax» проявлялось только в базальных условиях, но не при стимуляции фагоцитов. Под влиянием препарата снижение ХЛ-пика не было статистически значимым, характер кинетики принципиально не менялся, откуда следует, что при гиперпродукции АФК фагоцитами применение данного препарата, скорее всего, не будет эффективным.
При нормальном уровне продукции АФК фагоцитами под влиянием «Pax» высота пика также не изменялась, зато время достижения пика достоверно сокращалось с 55 до 30 минут (р < 0,05), что указывает на проявление регуляторного эффекта препаратов в отношении редокс-баланса крови.
Растительная основа препарата «Pax» (экстракты душистых трав – мелиссы, лаванды, дикого мака) обеспечивает широкий набор алифатических и циклических компонентов эфирных масел (цитраль до 60 %, гераниол, цитронеаль, мирцен, линолилацетат, линалоол, лавандуол, кариофиллен). Известно, что гидрофобные компоненты обладают высоким химическим сродством к липидам мембран и, связываясь с ними, повышают вязкость липидной фазы [1]. Биологическим эффектом таких взаимодействий у фагоцитов является активация мембраносвязанных ферментов, к которым относится НАДФ-оксидаза. Поэтому под влиянием этого препарата не может снижаться продукция АФК стимулированными фагоцитами, что и подтвердили полученные результаты. В базальных условиях стимуляции фагоцитов не происходит по определению, поэтому можно предположить, что выявленный антиоксидантный эффект препарата связан не с мембранными, а экстраклеточными скавенджерными взаимодействиями [4].
Рис. 1. Влияние препарата «Pax» на кинетику (А) и параметры (Б) активированного и базального ХЛ-ответа фагоцитов
В составе фитокомпозиции «Pax» содержание витамина РР (ниацин) превышает содержание других витаминов на 1–2 порядка. Ниацин является коферментом дегидрогеназ, осуществляющих окисление глюкозы. Через глюкогенный путь окисления реализуется распад многих органических субстратов, например глюкогенных аминокислот. Это означает, что ожидаемый эффект применения данного биопрепарата должен быть скорее прооксидантным, а не антиоксидантным. По-видимому, данный препарат может быть высоко эффективным в случае гипореактивных, но не нормо- или гиперактивных фагоцитов крови.
Сходным образом на кинетику выработки АФК циркулирующими фагоцитами влияли два других препарата – «LifePac Vital» и «ChromVital». Первый препарат, как и «Pax», характеризуется высоким содержанием ниацина. Кроме того, в его составе содержится повышенное количество витамина С, синергичное влияние которого может обусловить итоговый прооксидантный эффект. Среди ингредиентов препарата «ChromVital» наибольшей массовой долей (44 %) характеризовался экстракт элеутерококка колючего. Элеутерозиды А, В, С, Д, Е являются типичными прооксидантами, резко активирующими фагоцитоз и разрушение клеточных мембран [1]. Это приводит к выбросу в кровь многочисленных биологически активных метаболитов, являющихся маркёрами окислительного стресса, что, в свою очередь, включает компенсаторно-приспособительные реакции, ускоряющие метаболизм и обеспечивающие адаптогенные и лечебные эффекты. Как и рассмотренный выше «Pax», оба указанных препарата не влияли на высоту пика при ХЛ-ответе как нормореактивных, так и гиперактивных фагоцитов. Однако при их присутствии в реакционной смеси корректировался «правый сдвиг» ХЛ-кривой, что косвенно свидетельствует об ускорении прооксидантных процессов и подтверждает предположение о зависимости функциональных характеристик клеток-мишеней от химического состава и свойств рассмотренных биологически активных нутриентов.
Таким образом, вопреки рекламно-маркетинговой агитации, антиоксидантная активность у препаратов «Pax», «LifePac Vital» и «ChromVital» не была обнаружена. В то же время их применение может быть эффективным для коррекции баланса между продукцией и удалением АФК в крови при нормореактивном типе ХЛ-ответа фагоцитов. Данный тип нарушения редокс-баланса был выявлен у 7 % обследованных практически здоровых людей, асимптомность которых может соответствовать периоду предзаболевания. Своевременная алиментарная коррекция может предотвратить наступление реальной патологии с помощью питания как наиболее физиологичного способа регулирования метаболизма.
Ранее установлено, что у практически здоровых людей с высокой частотой (48 %) встречается не гипо- или нормо-, а гиперактивный тип генерации АФК [3]. На таком фоне, особенно при сокращении времени достижения пика (Tmax), экстракт элеутерококка может оказать нежелательное действие, спровоцировав резкое метаболическое истощение и функциональный срыв фагоцитов. Неизбежным следствием будет нарушение гомеостаза. Поэтому назначение препарата без учёта метаболической специфики организма потребителя может обеспечить не укрепление, а разрушение защитных сил организма.
В отличие от рассмотренных выше препаратов, влияние «Antiox» на продукцию АФК фагоцитами имело ярко выраженный антиоксидантный характер (рис. 2). Под влиянием препарата продукция АФК гиперактивными фагоцитами (превышение нормы Imax в 2,5 раза) снижалась до референтных значений без изменения времени достижения пика. Такой мощный антиоксидантный эффект, возможно, связан с химическими особенностями препарата: в его составе содержится богатый набор биофлавоноидов в сочетании с высоким содержанием аскорбиновой кислоты [6].
Рис. 2. Антиоксидантное влияние препарата «Antiox» на кинетику разноуровневого активированного ХЛ-ответа фагоцитов и нейтрофилов: 1, 2 – норма активированного (ХЛа) и базального (ХЛб) ответа фагоцитов; 3 – контроль ГР (гиперактивный); 4 – ГР + Antiox; 5 – контроль НР (нормореактивный); 6 – НР + Antiox; 7 – контроль Гп (гипореактивный); 8 – Гп + Antiox; 9 – Нф (нейтрофилы), контроль; 10 – Нф + Antiox
При этом важно отметить совпадение эффектов, наблюдаемых на цельной крови (рис. 2, кривые 3 и 4) и на монофракции стимулированных нейтрофилов (рис. 2, кривые 9 и 10). Это означает, что мишенью препарата действительно являются первичные клеточные продуценты АФК, а не другие компоненты химической матрицы. Данные согласуются с опубликованными в литературе сведениями о высокой антиоксидантной активности препарата «Antiox», используемого не только в качестве функционального продукта питания, но и как средства вспомогательной терапии послеоперационных, травматических, интоксикационных состояний [2]. При этом, однако, вряд ли стоит рассматривать его как универсальное средство коррекции окислительного стресса всегда и для всех. Это следует из анализа результатов на фоне исходной нормо- и гипопродукции фагоцитов (рис. 2, кривые 5–8): уровень продуцируемых ими свободнорадикальных метаболитов аномально подавляется. Известно, что в физиологических количествах АФК являются обязательными участниками важных процессов образования гормонов, простагландинов, белков, жирных кислот и др. Поэтому полученный результат можно расценивать как прогноз высокого риска применения препарата «Antiox» на фоне нарушений гомеостаза, не связанных с гиперпродукцией свободных радикалов.
Среди препаратов линии «VISION» имеются специализированные продукты для отдельных возрастных групп. Так, для детей предназначен препарат «LifePac Junior». Судя по полученным результатам, в условиях описанной экспериментальной модели у данного препарата не было выявлено ни антиоксидантной, ни прооксидантной активности (рис. 3). Базовым ингредиентом «LifePac Junior» является пиридоксин (витамин В6), кофермент окислительного переаминирования аминокислот. Данные процессы активно протекают в растущем организме поэтому у данного препарата вряд ли можно ожидать проявления антиоксидантных свойств. Полученные результаты согласуются с этим прогнозом, поскольку свободнорадикальный фон под влиянием препарата не снижался, а в двух случаях из десяти (гиперактивный ХЛ-ответ стимулированных фагоцитов, 120–150 % относительно референтных значений, на рисунке не показано) возрастал в 1,8 и 2,5 раза.
Рис. 3. Отсутствие изменения ХЛ-кинетики под влиянием препарата «LifePac Junior» (L.P.J.)
В итоге применение данного недешёвого препарата в лучшем случае может оказаться бесполезным, а в худшем – усилить окислительный стресс, являющийся метаболической основой патологий.
Выводы
- Среди исследованных препаратов только «Antiox» обладал антиоксидантным действием, которое может быть полезным лишь при гиперпродукции АФК в организме потребителя. При нормо- и гипопродукции свободных радикалов фагоцитами этот препарат может оказать негативное влияние.
- У препаратов «Pax», «LifePac Vital» и «Chromvital» не выявлена антиоксидантная либо прооксидантная активность, однако под их влиянием наблюдалась коррекция редокс-баланса за счёт усиления прооксидантных процессов только у нормо-реактивных фагоцитов. Под влиянием специализированного препарата «LifePac Junior» не было обнаружено достоверных изменений кинетических параметров крови вне зависимости от уровня их свободнорадикальной продуктивности.
- Влияние регуляторно-значимых микронутриентов на функциональную активность циркулирующих фагоцитов in vitro зависит не только от свойств тестируемых продуктов, но и от исходного уровня активности самих клеток-мишеней. Здоровьесберегающий эффект биологически активных компонентов питания определяется не только количественным и качественным составом препарата, но и особенностями редокс-баланса внутренней среды индивидуального организма, которые можно количественно оценить с помощью хемилюминесцентного анализа.
Рецензенты:
Климацкая Л.Г., д.м.н., профессор кафедры социальной педагогики и социальной работы КГПУ им. В.П. Астафьева, г. Красноярск;
Первышина Г.Г., д.б.н., профессор кафедры эколого-химической экспертизы товаров КГТЭИ СФУ, г. Красноярск.
Работа поступила в редакцию 30.04.2014.