Репаративная регенерация является сложным многоступенчатым процессом, в основе которого лежит комплекс биохимических, иммунологических и генетических механизмов. Несмотря на большое количество средств природного и синтетического происхождения, обладающих репаративными свойствами, проблема остается актуальной, так как существующие препараты не всегда достаточно эффективны [4, 5]. Литературные данные также свидетельствуют об актуальности и нерешенности проблемы профилактики хирургической инфекции, приобретающей все большую социально-экономическую значимость [3, 7].
Научно-практический интерес к исследованию биологической активности наночастиц меди определяется возможностью использования их в качестве регенерирующих и антибактериальных препаратов [4, 8, 9]. Медь играет важную роль в жизнедеятельности организма, оказывает катализирующее влияние на процессы полноценной регенерации тканей [2]. Несмотря на несомненную перспективность исследований в данной области, в литературе встречаются лишь отдельные работы, посвященные изучению влияния наночастиц меди на заживление ран.
Целью исследования явилась комплексная оценка репаративной регенерации в условиях условно-асептической экспериментальной раны под влиянием суспензии наночастиц меди.
Материалы и методы исследования
В работе использовали нанопорошки меди, синтезированные на плазмохимическом комплексе филиала Федерального Государственного Управления РФ «Государственный научно-исследовательский институт химии и технологии элементоорганических соединений» (ФГУП РФ ГНЦ ГНИИХТЭОС г. Москва). Объектом исследования явились 60 белых крыс-самцов, массой 130–140 г, у которых формировали полнослойную кожную рану размером 400 мм2 в межлопаточной области. Животные были разделены на 3 группы по 20 крыс в каждой: контрольная группа – интактные животные; группа сравнения – крысы с полнослойной кожной раной, рана заживала естественным путем; опытная группа – крысы с полнослойной кожной раной, получавшие лечение суспензией наночастиц меди.
Модель экспериментальной раны была получена следующим образом [6]: после предварительной обработки кожи, в асептических условиях, под наркозом, на выбритом от шерсти участке в межлопаточной области у крыс по контуру, предварительно нанесенному трафаретом, иссекали кожу с подкожной клетчаткой в виде квадрата 2×2 см (400 мм2).
На раневую поверхность животных опытной группы ежедневно накладывали стерильные салфетки, смоченные 1,0 мл суспензии наночастиц меди в изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации 0,01 мг/мл.
Для оценки эффективности лечения использовали экспериментальные, планиметрические, гематологические, гистологические, микробиологические и статистические методы.
Использовали планиметрический метод Л.Н. Поповой, основанный на регистрации скорости уменьшения раневой поверхности во времени: на рану помещали стерильную прозрачную пластинку полимера, на которую наносили контур раны, и считывали изображение с помощью сканера HP Scanjet 3970. Площадь раны рассчитывали с помощью компьютерной программы ImageJ.
Процент уменьшения площади раны за сутки определяли по формуле:
где S – площадь раны при предыдущем измерении; Sn – площадь раны при данном измерении; t – число дней между первым и последующим измерениями. Скорость заживления раны высчитывали по формуле:
где СЗ – скорость заживления площади раны в сутки; S – исходная площадь раны; Sn – площадь раны к сроку измерения; n – количество суток.
Изучение гематологических показателей проводили на анализаторе Micros 60 АВХ (Франция).
Препараты срезов кожи для гистоморфологического исследования окрашивали гематоксилином и эозином. Морфометрию раневой поверхности проводили на микроскопе Revelation III Sky Optic (10×40) с целью изучения динамики репаративных процессов в данных группах животных. В срезах кожи измеряли толщину эпидермиса по вертикали от базальной мембраны до рогового слоя (клеточный эпидермис), а также дермы. Исследовали по одному срезу от каждого животного. Подсчеты производили во всех полях зрения (20–25 полей зрения на срез), при этом в каждом поле зрения было сделано по три измерения. В каждой группе выполняли не менее 150 измерений соответствующего параметра.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы «Statistica 6.0», предназначенной для оценки результатов медицинских и биологических наблюдений, с вычислением средней арифметической (М), среднеквадратического отклонения (σ), средней ошибки средней арифметической (m), коэффициента достоверности (t), показателя вероятности (р).
Результаты исследования и их обсуждение
Во всех сериях экспериментов на 1-е сутки после моделирования условно-асептической раны средняя площадь ран, по данным планиметрического метода исследования, составила около 400 мм2. Изменения площади раневой поверхности опытной группы и группы сравнения в динамике отражены в табл. 1.
Таблица 1
Изменения площади раневой поверхности у экспериментальных животных в динамике наблюдения
|
Группы животных |
Площадь экспериментальной раны (мм2) после её моделирования на |
|||||
|
1-е |
3-и |
5-е |
7-е |
10-е |
14-е |
|
|
сутки |
||||||
|
Сравнения (n = 20) |
387,3 ± 2,4 |
408,7 ± 11,3 |
359,5 ± 14,3 |
359,5 ± 14,3 |
188,6 ± 10,3 |
74,3,1 ± 6,3 |
|
Опытная (n = 20) |
403,3 ± 9,2 |
325,3 ± 3,2 р < 0,05 |
98,3 ± 7,3 р < 0,001 |
38,1 ± 5,9 р < 0,001 |
11,3 ± 3,5 р < 0,001 |
0,0 |
Примечание. p – уровень достоверности различий данных опытной группы по отношению к группе сравнения.
У всех животных группы сравнения полного заживления экспериментальной раны не произошло к 14-м суткам наблюдения: в среднем к этому сроку площадь раны в группе сравнения уменьшилась на 78 %. У животных опытной группы уже на 7-е сутки площадь раны сократилась на 83,1 %, а к 14-м суткам раны полностью эпителизировались. Таким образом, суспензия наночастиц меди оказывала выраженное стимулирующее влияние на динамику регенерации экспериментальных ран у животных опытной группы.
Следует отметить, что у пяти крыс группы сравнения на 7-е сутки исследования было отмечено увеличение площади раны на 10–27 % по отношению к исходным показателям. При бактериологическом исследовании у данных животных идентифицировали Escherichia coli в количестве 5,3 ± 1,6·104 КОЕ/мл. Края ран были гиперемированными и отечными за счет вторичного их инфицирования, приводящего к увеличению раневой поверхности. У всех животных опытной группы, получавших лечение наночастицами меди, экспериментальные раны заживали без признаков вторичного инфицирования.
Максимальная скорость заживления экспериментальной раны у животных опытной группы на 5-е сутки (112,8 мм/сут) существенно превышала аналогичные показатели (35,1 мм/сут) в группе сравнения (p < 0,001).
Анализ суточного уменьшения площади ран в процентах показал, что применение наночастиц меди вызывает максимальное сокращение площади экспериментальной раны на 7–10-е сутки после её моделирования (на 27 %), затем среднее суточное уменьшение площади ран несколько снижается до 14 %. На наш взгляд, это связано с тем, что у части животных завершилась эпителизация ран. Различие между двумя группами животных по показателю средней скорости уменьшения площади ран было достоверно (р < 0,001) на всех сроках наблюдения, что доказывает высокую регенеративную эффективность наночастиц меди в виде суспензии.
Данные лейкоцитарной формулы животных опытной группы и группы сравнения на 14-е сутки наблюдения продемонстрировали различную степень выраженности общевоспалительной реакции организма крыс (табл. 2). Так, у животных группы сравнения отмечалось существенное увеличение количества палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов, а также общее число лейкоцитов по отношению к животным опытной группы, получавшим лечение суспензией наночастиц меди. В опытной группе эти показатели были близки к таковым в контрольной группе. Интересно отметить, что к 14-м суткам эксперимента количество лимфоцитов в опытной группе и группе сравнения было существенно ниже их содержания у контрольных животных.
Таблица 2
Лейкоцитарная формула животных на 14-е сутки наблюдения
|
Группы |
Количество лейкоцитов, 109/л |
Палочкоядерные нейтрофилы, % |
Сегментоядерные нейтрофилы |
Лимфоциты |
|
Контрольная |
12,7 ± 4,8· |
6,3 ± 2,3 |
21,3 ± 4,3 |
61,8 ± 4,3 |
|
Cравнения |
27,1 ± 3,2 p1-2 < 0,05 |
15,3 ± 2,7 p1-2 < 0,05 |
34,8 ± 5,1 p1-2 < 0,05 |
33,6 ± 2,5 p1-2 < 0,001 |
|
Опытная |
18,6 ± 4,1 p1-2 > 0,05 p2-3 < 0,05 |
10,4 ± 4,3 p1-2 > 0,05 p2-3 < 0,001 |
23,4 ± 4,5 p1-2 > 0,05 p2-3 < 0,05 |
38,3 ± 3,2 p1-2 < 0,001 p2-3 > 0,05 |
Примечания: p 1-2 – уровень достоверности различий показателей группы сравнения по отношению к контрольной группе; p 2-3 – уровень достоверности различий показателей опытной группы по отношению к группе сравнения.
Объективными показателями при изучении репаративной активности кожи крыс выступают морфометрические показатели раневой поверхности. Ниже приведены результаты измерения в динамике толщины эпидермиса и дермы в области экспериментальной раны и определения отношения толщины эпидермиса к толщине дермы у животных групп сравнения и опытной группы (табл. 3).
Таблица 3
Толщина слоев кожи экспериментальных животных в области раны на 21-е сутки
|
Показатель |
Группы животных |
||
|
Контрольная (n = 20) |
Сравнения (n = 20) |
Опытная (n = 20) |
|
|
Толщина эпидермиса, мкм |
27,4 ± 5,2 |
45,9 ± 3,8 p1-2 < 0,001 |
26,8 ± 4,5 p1-3 > 0,05 p2-3 < 0,01 |
|
Толщина дермы, мкм |
97,4 ± 4,6 |
125,9 ± 5,3 p1-2 < 0,001 |
93,1 ± 6,1 p1-3 > 0,05 p2-3 < 0,001 |
|
Эпидермис/дерма, отн.ед. |
0,25 ± 0,03 |
0,39 ± 0,03 p1-2 < 0,001 |
0,27 ± 0,02 p1-3 > 0,05 p2-3 < 0,001 |
Примечания: p 1-2 – уровень достоверности различий показателей группы сравнения по отношению к контрольной группе; p 2-3 – уровень достоверности различий показателей опытной группы по отношению к группе сравнения; p 1-3 – уровень достоверности различий показателей опытной группы по отношению к контрольной группе.
К 21-м суткам с момента формирования раны морфометрическое изучение гистологических показателей кожи свидетельствует о том, что в опытной группе толщина эпидермиса и дермы, а также их соотношение приближались к показателям контрольной группы, тогда как в группе сравнения эти показатели были достоверно выше (p < 0,001). В опытной группе раневой дефект был покрыт тонким и дифференцированным эпителием.
Заключение
Изучено и подтверждено стимулирующее влияние на регенерацию экспериментальной условно-асептической раны наночастиц меди с учетом комплекса показателей (планиметрических, гематологических, морфометрических, бактериологических). Под влиянием наночастиц меди отмечены изменения планиметрических исследований у животных опытной группы (уменьшение площади раны, увеличение скорости заживления ран), нормализация гематологических показателей. Морфометрическое изучение характеристик раневой поверхности также подтверждает оптимизацию репаративных процессов в экспериментальной ране. В работе показано выраженное профилактическое действие наночастиц меди в отношении вторичного инфицирования раны, что подтверждается данными бактериологических исследований.
Рецензенты:
Гладилин Г.П., д.м.н., профессор, зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики, ФПК и ППС, ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России, г. Саратов;
Волков А.А., д.в.н., профессор, заведующий кафедрой «Терапия, акушерство и фармакология», ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова», г. Саратов.
Работа поступила в редакцию 30.04.2014.