Важной составляющей здоровья женщины является нормальное функционирование ее репродуктивной системы. К сожалению, число бесплодных браков не имеет тенденции к снижению. В настоящее время установлено, что решающую роль в имплантации играет количество функционально полноценных рецепторов ткани эндометрия к соответствующим стероидным гормонам [5]. При этом эстрадиол повышает концентрацию рецепторов эстрадиола (РЭ) и прогестерона (РП) в цитолизе клеток, а прогестерон её снижает. В ходе нормального менструального цикла имеются широкие индивидуальные колебания содержания РЭ и РП в эндометрии. Максимальное количество РЭ и РП в эндометрии отмечается в овуляторный период, а в секреторную фазу их количество уменьшается [7, 8].
Патология синтеза рецепторов в матке может происходить под влиянием изменения количества и соотношения половых гормонов, поражения патологическим процессом матки, дисбаланса других гормонов [14].
Нарушение экспрессии рецепторов стероидных гормонов является ведущим в формировании гиперпластических процессов эндометрия и миомы матки. От состояния рецепторного аппарата матки и уровня сывороточных гормонов зависит также эффект от применяемой гормональной терапии вплоть до полной нечувствительности к ней.
Эстрогены и прогестерон обладают способностью взаимодействовать и с клетками системы макрофагов за счет присутствующих на их плазматической мембране рецепторов к стероидным гормонам [13].
Активация макрофагальных клеток сопровождается усилением экспрессии клеточных рецепторов [1, 4, 10]. В клетках при этом увеличивается количество первичных и вторичных лизосом, повышается активность лизосомных ферментов, изменяется стабильность лизосомных мембран [9].
Цель работы – определить процесс активации моноцитов крови и перитонеальных макрофагов по уровню синтеза и секреции ими лизосомного фермента лизоцима, показателю стабильности лизосомных мембран этих клеток у женщин с разной степенью экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов на клетках эндометрия в разные фазы маточного цикла.
Материалы и методы исследования
Исследованы моноциты крови и перитонеальные макрофаги у 63-х женщин репродуктивного возраста (30,5 ± 2,5 года), находившихся на лечении в КГБУЗ «Владивостокская клиническая больница № 1» и КГБУЗ «Владивостокский клинический родильный дом № 3» с трубно-перитонеальной формой бесплодия. Всем женщинам с диагностической целью проведены гистероскопия и выскабливание полости матки на 10-й или 21-й день менструального цикла в зависимости от времени поступления в стационар. Фаза маточного цикла определялась после гистологического исследования препарата в КГБУЗ «Владивостокское патологоанатомическое бюро». На все обследования пациентками получено информированное согласие.
По данным результатов гистологического исследования женщины разделены на две группы: пациентки, у которых эндометрий находился в фазе пролиферации (первая группа – 31 женщина) и в фазе секреции (вторая группа – 32 женщины). Выделение моноцитов крови проводилось на градиенте плотности фиколл-верографина центрифугированием крови в течение 30 минут при 400 G с последующим отсасыванием микропипеткой кольца градиента [11]. Клетки прикреплялись к поверхности стекла в течение 60 минут при температуре 37 °С. Перитонеальные макрофаги получали из суспензии, взятой методом пункций заднего влагалищного свода в день проводимой гистероскопии, также выделяли прикреплением клеток к поверхности стекла.
Концентрацию клеток считали в камере Горяева и доводили стерильным физиологическим раствором до 6∙106 кл /мл. Определение стабильности лизосомных мембран моноцитов крови и перитонеальных макрофагов с расчетом показателя стабильности (ПСЛМ) проводили методом культивирования выделенных клеток в среде 199 с добавлением 0,5 % стерильного L-глутамина и 2,5 % смешанной человеческой сыворотки, прогретой в течение 30 мин при 56 °С в течение 12–15 часов при 37 °С. Микрометодом проводили определение секретированного лизоцима (Lсекр), а после 4-6-кратного замораживания-оттаивания культивируемых клеток – общего лизоцима (Lобщ = Lсекретированный + Lвнутриклеточный) [3]. На основании полученных результатов секретированного и общего лизоцима высчитывали ПСЛМ по формуле ПСЛМ = Lсекр/Lобщ∙100 %. Повышение ПСЛМ выше оптимального значения (53–58 %) расценивалось как лабилизация лизосомных мембран, снижение этого показателя – как стабилизация мембран. По результатам оценки разницы Lобщ после и до культивирования определяли количество синтезированного лизоцима (Lсинт) [12].
Определение экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону проводили иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител (Dako, США) [2]. Производилась заливка фиксированных кусочков ткани эндометрия в парафин и делались тонкие срезы толщиной 4–5 мкм с помещением их по 3–4 образца на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином. Выявление тканевых антигенов проводили авидин-биотиновым методом, в котором биотилированные вторичные антитела взаимодействуют с соответствующими молекулами пероксидазно-конъюгированного стрептавидина.
Нагревали стекла со срезами, после чего гистологические препараты обрабатывали первичными иммунными сыворотками, содержащими мышиные моноклональные антитела соответственно к рецепторам эстрогенов (Э) и прогестерону (П). На каждом стекле 1 срез (контрольный) обрабатывали неиммунной мышиной сывороткой («Dako», USA). В качестве вторичных сывороток использовали антимышиные биотилированные антитела козы (ИМТЕК, Россия) в концентрации 1:100 и конъюгированную со стрептовидином полипероксидазу (ИМТЕК, Россия) в концентрации 1:100. Анализ окрашенных пероксидазным методом ядер производили при увеличении объектива х40. Среднюю интенсивность иммуногистохимической реакции оценивали по 4-бальной шкале на 100 клеток: 0 – отсутствие реакции, 1 – слабая реакция, 2 – умеренная реакция, 3 – сильная реакция
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета программ «Statistica 6» с применением стандартных методов вариационной статистики и критерия Манна‒Уитни для оценки статистически значимых различий. Различие считалось достоверным при р < 0,05 [6].
Результаты исследования и их обсуждение
Проведенное исследование показало, что экспрессия рецепторов к эстрадиолу и прогестерону на клетках эндометрия в разные фазы маточного цикла сопряжена с колебанием секреторно-синтетической активности моноцитов крови и перитонеальных макрофагов, а также показателем стабильности лизосомных мембран этих клеток.
В фазу пролиферации преобладает эстрадиол, и его действие ведет к нарастанию синтеза и экспрессии рецепторов к данному гормону [2]. Как видно из табл. 1, сильная экспрессия рецепторов на клетках эндометрия к данному гормону сопровождается лабилизацией лизосомных мембран моноцитов крови и перитонеальных макрофагов, в то время как слабая экспрессия рецепторов к эстрадиолу приводит к стабилизации лизосомных мембран этих клеток и снижению ПСЛМ (p < 0,001).
Соответственно секреторная активность моноцитов крови и перитонеальных макрофагов у женщин с сильной экспрессией рецепторов к эстрадиолу на клетках эндометрия наиболее высокая, что видно из табл. 2 (p < 0,001 – достоверное различие Lсекр моноцитов/макрофагов женщин с сильной и умеренной экспрессией рецепторов к эстрадиолу на клетках эндометрия с женщинами со слабой экспрессией рецепторов).
Таблица 1
Показатель стабильности лизосомных мембран моноцитов крови и перитонеальных макрофагов у женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов к эстрадиолу в пролиферативную фазу маточного цикла
|
Группы сравнения |
n |
ПСЛМ в % моноцитов (M ± m) |
ПСЛМ в % макрофагов (M ± m) |
|
|
Женщины со слабой экспрессией рецепторов |
10 |
p¹ |
45,7 ± 1,8 |
55,7 ± 1,0 |
|
Женщины с умеренной экспрессией рецепторов |
11 |
p² |
55,6 ± 2,0 p1-p2*** |
59,9 ± 1,2 p1-p2** |
|
Женщины с сильной экспрессией рецепторов |
10 |
p³ |
63,4 ± 1,7 p1-p3*** |
66,7 ± 1,9 p1-p3*** |
Примечания: (достоверность различия между сравниваемыми группами):
** – различие значимо p < 0,01;
*** – различие значимо.
Таблица 2
Уровень секреции лизоцима моноцитами крови и перитонеальными макрофагами у женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов к эстрадиолу в пролиферативную фазу маточного цикла
|
Группы сравнения |
n |
Lсекр мкг/мл моноцитов (M ± m) |
Lсекр, мкг/мл макрофагов (M ± m) |
|
|
Женщины со слабой экспрессией рецепторов |
10 |
p¹ |
0,65 ± 0,03 |
0,76 ± 0,020 |
|
Женщины с умеренной экспрессией рецепторов |
11 |
p² |
0,78 ± 0,02 p1-p2*** |
0,94 ± 0,018 p1-p2*** |
|
Женщины с сильной экспрессией рецепторов |
10 |
p³ |
0,97 ± 0,07 p1-p3*** |
1,30 ± 0,120 p1-p3*** |
Примечания: (достоверность различия между сравниваемыми группами)
*** – различие значимо p < 0,001.
Таблица 3
Уровень синтеза лизоцима (Lсинт) моноцитами крови и перитонеальными макрофагами у женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов к эстрадиолу в пролиферативную фазу маточного цикла
|
Группы сравнения |
n |
Lсинт, мкг/мл моноцитов (M ± m) |
Lсинт, мкг/мл макрофагов (M ± m) |
|
|
Женщины со слабой экспрессией рецепторов |
10 |
p¹ |
0,49 ± 0,015 |
0,76 ± 0,02 |
|
Женщины с умеренной экспрессией рецепторов |
11 |
p² |
0,43 ± 0,012 p1-p2** |
0,7 ± 0,01 p1-p2*** |
|
Женщины с сильной экспрессией рецепторов |
10 |
p³ |
0,4 ± 0,025 p1-p3** |
0,69 ± 0,01 p1-p3*** |
Примечания: (достоверность различия между сравниваемыми группами)
** – различие значимо p < 0,01;
*** – различие значимо p < 0,001.
Синтез лизоцима моноцитами/макрофагами находится в обратной зависимости от уровня экспрессии рецепторов на клетках эндометрия к эстрадиолу, и, очевидно, от содержания эстрадиола (p < 0,001).
В секреторную фазу маточного цикла, развивающуюся после овуляции и образования желтого тела, закономерным образом происходит подъем содержания прогестерона и спад уровня эстрадиола. При этом наступает резкое снижение экспрессии рецепторов на клетках эндометрия к эстрадиолу и длительная экспрессия рецепторов к прогестерону [2].
Таблица 4
Показатель стабильности лизосомных мембран моноцитов крови и перитонеальных макрофагов у женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов к прогестерону в секреторную фазу маточного цикла
|
Группы сравнения |
n |
ПСЛМ в % моноцитов (M ± m) |
ПСЛМ в % макрофагов (M ± m) |
|
|
Женщины со слабой экспрессией рецепторов |
11 |
p¹ |
56,7 ± 1,1 |
63,7 ± 1,3 |
|
Женщины с умеренной экспрессией рецепторов |
10 |
p² |
55,6 ± 1,9 p1-p2* |
59,9 ± 2,4 p1-p2* |
|
Женщины с сильной экспрессией рецепторов |
11 |
p³ |
45,4 ± 2,5 p1-p3*** |
49,7 ± 1,8 p1-p3*** |
Примечания: (достоверность различия между сравниваемыми группами)
* – различие незначимо p > 0,05;
*** – различие значимо p < 0,001.
Из табл. 4 видно, что при слабой и умеренной экспрессии рецепторов на клетках эндометрия к прогестерону наблюдается практически одинаковое значение ПСЛМ как моноцитов, так и макрофагов с незначительным преобладанием его в группе женщин со слабой экспрессией рецепторов (p > 0,05). С усилением экспрессии рецепторов к прогестерону происходит значительное снижение ПСЛМ макрофагальных клеток (p < 0,001), свидетельствуя о происходящей стабилизации их лизосомных мембран.
Секреторная активность моноцитов/макрофагов в группе женщин со слабой экспрессией рецепторов к прогестерону на клетках эндометрия повышена, особенно у перитонеальных макрофагов (p < 0,01) по сравнению с ее значением у женщин с умеренной экспрессией рецепторов к гормону. При сильной экспрессии рецепторов к прогестерону наблюдается снижение секреции лизоцима в моноцитах крови и перитонеальных макрофагах (p < 0,001). Это может быть связано с прямым возрастающим действием прогестерона на клетки системы макрофагов или опосредованным за счет вариации числа рецепторов к гормону. Вполне вероятно, параллельно количественному изменению рецепторов на клетках эндометрия может происходить их изменение на мембранах макрофагальных клеток.
Таблица 5
Уровень синтеза лизоцима (Lсинт) моноцитами крови и перитонеальными макрофагами у женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов к прогестерону в секреторную фазу маточного цикла
|
Группы сравнения |
n |
Lсинт, мкг/мл моноцитов (M ± m) |
Lсинт, мкг/мл макрофагов (M ± m) |
|
|
Женщины со слабой экспрессией рецепторов |
11 |
p¹ |
0,44 ± 0,012 |
0,71 ± 0,010 |
|
Женщины с умеренной экспрессией рецепторов |
10 |
p² |
0,47 ± 0,02 p1-p2* |
0,76 ± 0,01 p1-p2** |
|
Женщины с сильной экспрессией рецепторов |
11 |
p³ |
0,56 ± 0,024 p1-p3*** |
0,84 ± 0,020 p1-p3*** |
Примечания: (достоверность различия между сравниваемыми группами)
* – различие незначимо p > 0,05;
*** – различие значимо p < 0,001.
Синтез лизоцима моноцитами/макрофагами также варьируется в секреторную фазу маточного цикла, что может быть также связано с действием прогестерона опосредованно через рецепторы к гормону.
Из табл. 5 видно, что при сильной экспрессии рецепторов на клетках эндометрия к прогестерону имеет место наибольший уровень синтеза лизоцима моноцитами крови и перитонеальными макрофагами (p < 0,001), при слабой экспрессии рецепторов к прогестерону наблюдается снижение синтеза лизоцима этими клетками.
Заключение
Таким образом, исследование секреторно-синтетической активности моноцитов крови и перитонеальных макрофагов у женщин в разные фазы менструального цикла выявило взаимосвязь процесса активации макрофагальных клеток с уровнем экспрессии рецепторов на клетках эндометрия к эстрадиолу и прогестерону. Происходящие при этом изменения в макрофагальных клетках определяют процесс их активации и степень возможного участия в реализации репродуктивной функции женщины за счет эффекторного действия клеток и их лизосомных ферментов. Проведенное исследование позволяет рекомендовать в качестве альтернативного метода лечения женщинам с нарушенной экспрессией рецепторов на клетках эндометрия к стероидным гормонам иммунокоррегирующую терапию, воздействующую на макрофагальное звено. Она может использоваться как самостоятельно, так и вместе с гормональными препаратами.
Рецензенты:Рева Г.В., д.м.н., профессор кафедры фундаментальной медицины, ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет», г. Владивосток;
Плехова Н.Г., д.б.н., заведующая лабораторией патоморфологии и электронной микроскопии, ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова» СО РАМН, г. Владивосток.
Работа поступила в редакцию 18.02.2014.