Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Храмова И.А. 1 Слюсарева Е.Е. 1 Каредина В.С. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России

Исследованы уровни синтеза и секреции лизоцима моноцитами крови и перитонеальными макрофагами, стабильность лизосомных мембран этих клеток у 63-х женщин с разной степенью экспрессии рецепторов к половым гормонам на клетках эндометрия. Выявлено, что сильная экспрессия рецепторов к эстрадиолу в пролиферативную фазу маточного цикла сопровождается лабилизацией лизосомных мембран моноцитов/макрофагов, увеличением секреции клеточного лизоцима при снижении его синтеза. Напротив, сильная экспрессия рецепторов к прогестерону в секреторную фазу маточного цикла ведет к стабилизации лизосомных мембран этих клеток, снижению секреции и увеличению синтеза лизоцима в них. Происходящие изменения в моноцитах крови и перитонеальных макрофагах определяют процесс их активации и степень возможного участия в реализации репродуктивной функции женщины за счет эффекторного действия клеток и их лизосомных ферментов.

Статья в формате PDF

325 KB

макрофаги

лизоцим

экспрессия рецепторов

эндометрий

1. Говалло В.И. Иммунология репродукции. – М.: Медицина, 1987. – 304 с.

2. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии / О.Н. Лысенко, М.Х. Ашхаб, Н.В. Стрижова, И.И. Бабиченко // Архив патологии. – 2004. – № 2. – С. 7–10.

3. Мотавкина Н.С., Шаронов А.С., Ковалев Б.М. Микрометоды в иммунологии. – Владивосток: ДВГУ, 1987. – 184 с.

4. Плехова Н.Г., Сомова Л.М. Роль моноцитов/макрофагов в патогенезе вирусных инфекций // Тихоокеанский мед. журн. – 2010. – № 3. – С. 5–9.

5. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельчен ко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000. – № 3. – С. 5–8.

6. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение прикладных программ «Statistica». – М.: Медиа сфера, 2002. – 305 с.

7. Роль половых гормонов и их рецепторного аппарата при выборе лечения у пациенток с гиперпластическими процессами в эндометрии в сочетании с миомой матки / Н.В. Стрижова, П.В. Сергеев, О.Н. Лысенко, Л.Р. Баянова, О.А. Нестерова, Е.Н. Кареева, Н.В. Кирпичников, Н.И. Слепцова // Акушерство и гинекология. – 1998. – № 3. – С. 30–33.

8. Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология. – М.: МИА, 2000. – 592 с.

9. Сходова С.А., Дроженников В.А., Белякова Е.А. Активация лизосомального аппарата фагоцитов миелопептидами // Иммунология. – 1986. – № 5. – С. 84–85.

10. Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы: развитие, активация, эффекторные функции // Rus. J. Immunol. – 1999. – Vol. 4, Suppl. 1. – P. 9–15.

11. Чередеев А.Н. Количественная и функциональная оценка Т и В систем иммунитета у человека // Общие вопросы патологии. Итоги науки и техники. – М.: ВИНИТИ, 1976. – Т. 4. – С. 124–160.

12. Шаронов А.С. Фагоциты, лизосомы, мембраны. – Владивосток: Дальнаука, 2007. – 128 с.

13. Fuchs V., Kotasek A., Vackova L. Nektere Immunologicke zmenypri gestozach // Cs: Gynek. – 1980. – Vol. 45, № 8. – Р. 548–553.

14. Richards P.A., Tiltman A.J. Anatomical variation of the estrogen receptor in the non–neoplastic myometrium of fibromyomatous uteri // Virchows Arch. – 1996. – Vol. 193, № 8. – Р. 265–275.

Важной составляющей здоровья женщины является нормальное функционирование ее репродуктивной системы. К сожалению, число бесплодных браков не имеет тенденции к снижению. В настоящее время установлено, что решающую роль в имплантации играет количество функционально полноценных рецепторов ткани эндометрия к соответствующим стероидным гормонам [5]. При этом эстрадиол повышает концентрацию рецепторов эстрадиола (РЭ) и прогестерона (РП) в цитолизе клеток, а прогестерон её снижает. В ходе нормального менструального цикла имеются широкие индивидуальные колебания содержания РЭ и РП в эндометрии. Максимальное количество РЭ и РП в эндометрии отмечается в овуляторный период, а в секреторную фазу их количество уменьшается [7, 8].

Патология синтеза рецепторов в матке может происходить под влиянием изменения количества и соотношения половых гормонов, поражения патологическим процессом матки, дисбаланса других гормонов [14].

Нарушение экспрессии рецепторов стероидных гормонов является ведущим в формировании гиперпластических процессов эндометрия и миомы матки. От состояния рецепторного аппарата матки и уровня сывороточных гормонов зависит также эффект от применяемой гормональной терапии вплоть до полной нечувствительности к ней.

Эстрогены и прогестерон обладают способностью взаимодействовать и с клетками системы макрофагов за счет присутствующих на их плазматической мембране рецепторов к стероидным гормонам [13].

Активация макрофагальных клеток сопровождается усилением экспрессии клеточных рецепторов [1, 4, 10]. В клетках при этом увеличивается количество первичных и вторичных лизосом, повышается активность лизосомных ферментов, изменяется стабильность лизосомных мембран [9].

Цель работы – определить процесс активации моноцитов крови и перитонеальных макрофагов по уровню синтеза и секреции ими лизосомного фермента лизоцима, показателю стабильности лизосомных мембран этих клеток у женщин с разной степенью экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов на клетках эндометрия в разные фазы маточного цикла.

Материалы и методы исследования

Исследованы моноциты крови и перитонеальные макрофаги у 63-х женщин репродуктивного возраста (30,5 ± 2,5 года), находившихся на лечении в КГБУЗ «Владивостокская клиническая больница № 1» и КГБУЗ «Владивостокский клинический родильный дом № 3» с трубно-перитонеальной формой бесплодия. Всем женщинам с диагностической целью проведены гистероскопия и выскабливание полости матки на 10-й или 21-й день менструального цикла в зависимости от времени поступления в стационар. Фаза маточного цикла определялась после гистологического исследования препарата в КГБУЗ «Владивостокское патологоанатомическое бюро». На все обследования пациентками получено информированное согласие.

По данным результатов гистологического исследования женщины разделены на две группы: пациентки, у которых эндометрий находился в фазе пролиферации (первая группа – 31 женщина) и в фазе секреции (вторая группа – 32 женщины). Выделение моноцитов крови проводилось на градиенте плотности фиколл-верографина центрифугированием крови в течение 30 минут при 400 G с последующим отсасыванием микропипеткой кольца градиента [11]. Клетки прикреплялись к поверхности стекла в течение 60 минут при температуре 37 °С. Перитонеальные макрофаги получали из суспензии, взятой методом пункций заднего влагалищного свода в день проводимой гистероскопии, также выделяли прикреплением клеток к поверхности стекла.

Концентрацию клеток считали в камере Горяева и доводили стерильным физиологическим раствором до 6∙106 кл /мл. Определение стабильности лизосомных мембран моноцитов крови и перитонеальных макрофагов с расчетом показателя стабильности (ПСЛМ) проводили методом культивирования выделенных клеток в среде 199 с добавлением 0,5 % стерильного L-глутамина и 2,5 % смешанной человеческой сыворотки, прогретой в течение 30 мин при 56 °С в течение 12–15 часов при 37 °С. Микрометодом проводили определение секретированного лизоцима (Lсекр), а после 4-6-кратного замораживания-оттаивания культивируемых клеток – общего лизоцима (Lобщ = Lсекретированный + Lвнутриклеточный) [3]. На основании полученных результатов секретированного и общего лизоцима высчитывали ПСЛМ по формуле ПСЛМ = Lсекр/Lобщ∙100 %. Повышение ПСЛМ выше оптимального значения (53–58 %) расценивалось как лабилизация лизосомных мембран, снижение этого показателя – как стабилизация мембран. По результатам оценки разницы Lобщ после и до культивирования определяли количество синтезированного лизоцима (Lсинт) [12].

Определение экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону проводили иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител (Dako, США) [2]. Производилась заливка фиксированных кусочков ткани эндометрия в парафин и делались тонкие срезы толщиной 4–5 мкм с помещением их по 3–4 образца на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином. Выявление тканевых антигенов проводили авидин-биотиновым методом, в котором биотилированные вторичные антитела взаимодействуют с соответствующими молекулами пероксидазно-конъюгированного стрептавидина.

Нагревали стекла со срезами, после чего гистологические препараты обрабатывали первичными иммунными сыворотками, содержащими мышиные моноклональные антитела соответственно к рецепторам эстрогенов (Э) и прогестерону (П). На каждом стекле 1 срез (контрольный) обрабатывали неиммунной мышиной сывороткой («Dako», USA). В качестве вторичных сывороток использовали антимышиные биотилированные антитела козы (ИМТЕК, Россия) в концентрации 1:100 и конъюгированную со стрептовидином полипероксидазу (ИМТЕК, Россия) в концентрации 1:100. Анализ окрашенных пероксидазным методом ядер производили при увеличении объектива х40. Среднюю интенсивность иммуногистохимической реакции оценивали по 4-бальной шкале на 100 клеток: 0 – отсутствие реакции, 1 – слабая реакция, 2 – умеренная реакция, 3 – сильная реакция

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета программ «Statistica 6» с применением стандартных методов вариационной статистики и критерия Манна‒Уитни для оценки статистически значимых различий. Различие считалось достоверным при р < 0,05 [6].

Результаты исследования и их обсуждение

Проведенное исследование показало, что экспрессия рецепторов к эстрадиолу и прогестерону на клетках эндометрия в разные фазы маточного цикла сопряжена с колебанием секреторно-синтетической активности моноцитов крови и перитонеальных макрофагов, а также показателем стабильности лизосомных мембран этих клеток.

В фазу пролиферации преобладает эстрадиол, и его действие ведет к нарастанию синтеза и экспрессии рецепторов к данному гормону [2]. Как видно из табл. 1, сильная экспрессия рецепторов на клетках эндометрия к данному гормону сопровождается лабилизацией лизосомных мембран моноцитов крови и перитонеальных макрофагов, в то время как слабая экспрессия рецепторов к эстрадиолу приводит к стабилизации лизосомных мембран этих клеток и снижению ПСЛМ (p < 0,001).

Соответственно секреторная активность моноцитов крови и перитонеальных макрофагов у женщин с сильной экспрессией рецепторов к эстрадиолу на клетках эндометрия наиболее высокая, что видно из табл. 2 (p < 0,001 – достоверное различие Lсекр моноцитов/макрофагов женщин с сильной и умеренной экспрессией рецепторов к эстрадиолу на клетках эндометрия с женщинами со слабой экспрессией рецепторов).

Таблица 1

Показатель стабильности лизосомных мембран моноцитов крови и перитонеальных макрофагов у женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов к эстрадиолу в пролиферативную фазу маточного цикла

Примечания: (достоверность различия между сравниваемыми группами):

** – различие значимо p < 0,01;

*** – различие значимо.

Таблица 2

Уровень секреции лизоцима моноцитами крови и перитонеальными макрофагами у женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов к эстрадиолу в пролиферативную фазу маточного цикла

Примечания: (достоверность различия между сравниваемыми группами)

*** – различие значимо p < 0,001.

Таблица 3

Уровень синтеза лизоцима (Lсинт) моноцитами крови и перитонеальными макрофагами у женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов к эстрадиолу в пролиферативную фазу маточного цикла

Примечания: (достоверность различия между сравниваемыми группами)

** – различие значимо p < 0,01;

*** – различие значимо p < 0,001.

Синтез лизоцима моноцитами/макрофагами находится в обратной зависимости от уровня экспрессии рецепторов на клетках эндометрия к эстрадиолу, и, очевидно, от содержания эстрадиола (p < 0,001).

В секреторную фазу маточного цикла, развивающуюся после овуляции и образования желтого тела, закономерным образом происходит подъем содержания прогестерона и спад уровня эстрадиола. При этом наступает резкое снижение экспрессии рецепторов на клетках эндометрия к эстрадиолу и длительная экспрессия рецепторов к прогестерону [2].

Таблица 4

Показатель стабильности лизосомных мембран моноцитов крови и перитонеальных макрофагов у женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов к прогестерону в секреторную фазу маточного цикла

Примечания: (достоверность различия между сравниваемыми группами)

* – различие незначимо p > 0,05;

*** – различие значимо p < 0,001.

Из табл. 4 видно, что при слабой и умеренной экспрессии рецепторов на клетках эндометрия к прогестерону наблюдается практически одинаковое значение ПСЛМ как моноцитов, так и макрофагов с незначительным преобладанием его в группе женщин со слабой экспрессией рецепторов (p > 0,05). С усилением экспрессии рецепторов к прогестерону происходит значительное снижение ПСЛМ макрофагальных клеток (p < 0,001), свидетельствуя о происходящей стабилизации их лизосомных мембран.

Секреторная активность моноцитов/макрофагов в группе женщин со слабой экспрессией рецепторов к прогестерону на клетках эндометрия повышена, особенно у перитонеальных макрофагов (p < 0,01) по сравнению с ее значением у женщин с умеренной экспрессией рецепторов к гормону. При сильной экспрессии рецепторов к прогестерону наблюдается снижение секреции лизоцима в моноцитах крови и перитонеальных макрофагах (p < 0,001). Это может быть связано с прямым возрастающим действием прогестерона на клетки системы макрофагов или опосредованным за счет вариации числа рецепторов к гормону. Вполне вероятно, параллельно количественному изменению рецепторов на клетках эндометрия может происходить их изменение на мембранах макрофагальных клеток.

Таблица 5

Уровень синтеза лизоцима (Lсинт) моноцитами крови и перитонеальными макрофагами у женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов к прогестерону в секреторную фазу маточного цикла

Примечания: (достоверность различия между сравниваемыми группами)

* – различие незначимо p > 0,05;

*** – различие значимо p < 0,001.

Синтез лизоцима моноцитами/макрофагами также варьируется в секреторную фазу маточного цикла, что может быть также связано с действием прогестерона опосредованно через рецепторы к гормону.

Из табл. 5 видно, что при сильной экспрессии рецепторов на клетках эндометрия к прогестерону имеет место наибольший уровень синтеза лизоцима моноцитами крови и перитонеальными макрофагами (p < 0,001), при слабой экспрессии рецепторов к прогестерону наблюдается снижение синтеза лизоцима этими клетками.

Заключение

Таким образом, исследование секреторно-синтетической активности моноцитов крови и перитонеальных макрофагов у женщин в разные фазы менструального цикла выявило взаимосвязь процесса активации макрофагальных клеток с уровнем экспрессии рецепторов на клетках эндометрия к эстрадиолу и прогестерону. Происходящие при этом изменения в макрофагальных клетках определяют процесс их активации и степень возможного участия в реализации репродуктивной функции женщины за счет эффекторного действия клеток и их лизосомных ферментов. Проведенное исследование позволяет рекомендовать в качестве альтернативного метода лечения женщинам с нарушенной экспрессией рецепторов на клетках эндометрия к стероидным гормонам иммунокоррегирующую терапию, воздействующую на макрофагальное звено. Она может использоваться как самостоятельно, так и вместе с гормональными препаратами.

Рева Г.В., д.м.н., профессор кафедры фундаментальной медицины, ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет», г. Владивосток;

Плехова Н.Г., д.б.н., заведующая лабораторией патоморфологии и электронной микроскопии, ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова» СО РАМН, г. Владивосток.

Работа поступила в редакцию 18.02.2014.

Библиографическая ссылка