Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

MICROBIOLOGICAL BIOSENSORS FOR DETECTION OF ANTIRADICAL ACTIVITY OF VARIOUS SUBSTANCES

Ryabchenko A.V. 1 Beklemishev A.B. 1
1 Federal State Budgetary Institution «Scientific Research Institute of Biochemistry» under the Siberian Branch Russian Academy of Medical Sciences
In the work presented by the material testing biosensor cell based on the Escherichia coli (E.coli), for detecting the antiradical activity of substances. As a source of radicals used ultraviolet radiation (UVR). Biosensor cells containing plasmid pRAC. The structure region of fluorescent gfp gene was cloned into these plasmid under the recA-promoters Proteus mirabilis. Biosensor cells under UVR initiated repair SOS-mechanism and synthesized green fluorescent protein, which is easily measured by fluorimeter device in situ. If the substance has antiradical activity, cell fluorescence decreased. As antiradical substances have been investigated ascorbic acid, metiletilpiridinol (trade name «Emoksipin»), «Thiophane» and «Thiophane-M». In all cases there was a significant decrease in cell fluorescence biosensor about 10-20 %. Biosensor may be useful for primary screening and detection of antiradical activity of different substances, non-toxic for E.coli.
biosensor
E.coli
green fluorescent protein (gfp)
antiradical protection
ultraviolet radiation (UVR)
1.Zenkov N.K., Men’shikova E.B., Kandalinceva N.V., Olejnik A.S., Prosenko A.E., Gusachenko O.N., Shkljaeva O.A., Vavilin V.A., Ljahovich V.V. Antioksidantnye i protivovospalitel’nye svojstva novyh vodorastvorimyh serosoderzhashhih fenol’nyh soedinenij // Biohimija 2007. T. 72. no.6. рр. 790–798.
2.Lavrinenko I.A., Rjabchenko A.V., Beklemishev A.B. Sozdanie cel’nokletochnoj biosensornoj test-sistemy dlja obnaruzhenija genotoksicheskih vozdejstvij na kletku // Vestnik NGU. 2007. T. 5, no.1. рр. 95–99.
3.Men’shikova E.B., Lankin V.Z., Kandalinceva N.V. Fenol’nye antioksidanty v biologii i medicine. Stroenie svojstva, mehanizmy dejstvija Germanija: Izdatel’stvo Lap Lambert Academic Publishing, 2012 496 p.
4.Rockaja U.N., Ovchinnikova L.P., Vasjunina E.A., Sinicina O.I., Kandalinceva N.V., Prosenko E.A., Nevinskij G.A. Ocenka citotoksichnosti i jeffektivnosti antioksidantnyh svojstv gidrofil’nyh proizvodnyh 2,4,6-trialkilfenolov v kletkah Escherichia coli // Biomedicinskaja himija. 2011. T. 57. no.3. pp. 326–334.
5.Rjabchenko A.V. Poluchenie rekombinantnyh belkov zapadnosibirskih izoljatov Borrelia burgdorferi sensu lato i izuchenie ih antigennyh svojstv: Avtoref. dis. kand. biol. nauk. Novosibirsk, 2009 20 p.
6.Rjabchenko A.V., Lavrinenko I.A., Beklemishev A.B. Rekombinantnaja plazmidnaja DNK dlja obnaruzhenija agentov, povrezhdajushhih geneticheskij apparat kletki (varianty) // Patent Rossii no.2311459. 2007.
7.Kostrzynska M., Leung K., Lee H., Trevors J. Green fluorescent biosensor for detecting SOS-inducing activity of genotoxic com-pounds // J. Microbiol. Methods. 2002. Vol. 48. pp. 43–51.
8.Radman M. Phenomenology of an inducible mutagenic DNA repair pathway in Escherichia coli: SOS repair pichulein hypothesis // Basic Life Sciences 5A. 1975. pp. 355–367.
9.Yagi K. Applications of whole-cell bacterial sensors in biotechnology and environmental science // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. Vol.73. pp. 1251–1258.

Ранее в нашей лаборатории был сконструирован биосенсор для обнаружения генотоксического воздействия (повреждение ДНК или ферментативного аппарата обслуживающего геном клетки) различных веществ на клетку. Известно, что при повреждениях ДНК в клетке и, в частности,
в E.coli, запускается SOS-система репарации ДНК, впервые описанная в 1975 г. М. Радманом [8]. При запуске SOS-системы активируется промотор recA-гена, отвечающего за синтез соответствующего RecA-белка, который играет ключевую роль в нескольких путях репарации повреждений ДНК [7]. Ранее нами была сконструирована плазмидная ДНК (pRAC), содержащая ген зеленого флюоресцирующего белка под регуляторной областью промотора recA-гена Proteus mirabilis. Плазмидная ДНК была встроена в клетки кишечной палочки. Таким образом, биосенсор был основан на клетках E.coli штамм BL21(DE3) и при нарушении генетического аппарата клетки биосенсора продуцировали зеленый флюоресцирующий белок (GFP), который легко регистрировался флуориметром непосредственно в культуре клеток [6]. В качестве генотоксикантов нами были проверены формальдегид, митомицин С, налидиксовая кислота, перекись водорода и ультрафиолетовое облучение (УФО с длинной волны ~254 нм). Эксперименты показали, что клетка отвечает синтезом GFP на все исследованные мутагены и в основном дозозависимым
образом [2, 5].

Помимо промотора recA-гена в литературе описаны конструкции другими промоторами генов SOS-репаративного ответа [9]. Однако все эти конструкции использовались для непосредственного определения генотоксикантов (прямой анализ), и нет работ, где с помощью этих конструкций определялись бы эффекты, направленные на подавление или устранение эффекта генотоксиканта (своего рода «обратный» анализ). Поскольку УФО ведет к образованию свободных радикалов в клетке, мы предположили возможность использования данной модели для обнаружения защитных эффектов различных веществ, обладающих антирадикальной активностью. При добавлении таких веществ к клеткам
биосенсора в условиях стресса – под действием УФО, уровень флуоресценции клеток должен снижаться. Целью настоящего исследования явилось изучение возможности использования биосенсора – клеток E.coli шт.BL21(DE3), содержащих плазмиду pRAC, для обнаружения антирадикальной активности различных веществ.

Материалы и методы исследования

В качестве биосенсора использовались клетки E.coli штамм BL21(DE3), содержащие плазмиду pRAC и обладающие устойчивостью к ампициллину. В качестве веществ, обладающих антирадикальной активностью исследовались аскорбиновая кислота (5 % раствор, ЗАО «Новосибхимфарм», г. Новосибирск, Россия), метилэтилпиридинол (торговое название «Эмоксипин», 1 % раствор, ФГУП «Московский эндокринный завод», г. Москва, Россия), бис-[(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил]сульфид («Тиофан») и 4-додецил-тиометил-2,6-диметилфенол («Тиофан-М») (кафедра химии, Институт естественных и социально-экономических наук, г. Новосибирск, Россия), структурные формулы веществ представлены на рис. 1.

pic_56.tif

Рис. 1. Структурные формулы исследованных веществ

Клетки выращивали на среде Луриа‒Бертани, содержащей ампициллин 100 мкг/мл, в колбе на ротационном шейкере при 37 °C. Культуру клеток в логарифмической фазе роста (1,0–1,5 о.е., D600) разливали в культуральные полистироловые планшеты (по 1 мл в лунку) и добавляли в различных концентрациях исследуемые вещества. Клетки инкубировали на ротационном шейкере (180 об/мин) в течение 20–30 мин при комнатной температуре, после чего планшеты инкубировали при аналогичных условиях под УФО в течение необходимого периода. В качестве источника УФО использовалась лампа ртутная бактерицидная ДБ-60 (λ ~ 254 нм, мощность 60 Вт), расстояние от лампы до планшетов составляло 50 см. По окончании инкубации проводился замер оптической плотности (ОП) культуры клеток (спектрофотометр «Evoluion 300 V-VIS», США) и флуоресценции (флуориметр «Shimadzu RF-530» (РС), Япония). Измерения проводили непосредственно в культуре клеток, без их разрушения. Волна возбуждения зеленого флюоресцирующего белка 480 нм, эмиссии – 515 нм.

Для сравнения результатов исследуемых культур флуоресценцию нормировали на оптическую плотность культуры клеток и вычисляли фактор индукции (ФИ) по методу, описанному в работе Лавриненко [2]. Каждый образец повторяли три раза. Обработку полученных результатов проводили с применением методов вариационной статистики. В сравниваемых группах определяли средние величины (М), ошибку средних величин ( ± m). Математическую обработку выполняли с помощью программы «StatPlus 2009» (компания «StatSoft», USA). Аскорбиновая кислота и метилэтилпиридинол являются водорастворимыми веществами. Растворы «Тиофана» и «Тиофана-М» с высокой концентрацией веществ готовили в 100 % диметилсульфоксиде, до исследуемых концентраций вещества растворяли 96 % этанолом, поэтому контрольные клетки содержали аналогичный объем растворителя без исследуемых веществ.

Результаты исследования
и их обсуждение

На предварительном этапе работ было исследовано время экспозиции клеток биосенсора под УФО для выбора оптимальных условий инкубации. Клетки инкубировали в течение суток под УФО. Через определенный промежуток времени ряд лунок экранировался от УФО, контрольные лунки были экранированы с начала инкубации. По окончании инкубации производились соответствующие замеры, вычисления фактора индукции и построение кривых изменения ОП и ФИ от времени. Результаты эксперимента представлены на рис. 2.

Из графика видно, что ОП клеток уменьшается в результате угнетающего действия УФО, а флуоресценция увеличивается вследствие накопления в клетках GFP. Из результатов этого эксперимента следует, что в исследованные периоды максимальный ФИ приходится на четырехчасовой период инкубации, т.е. в этой точке флюоресценция облучаемых клеток в восемь раз больше, чем в контрольных. Мы посчитали эту разницу вполне достаточной для проявления антирадикальных защитных эффектов, поэтому в последующих экспериментах остановились на четырехчасовой инкубации клеток.

pic_57.tif

Рис. 2. Кривые изменения ОП культуры клеток и ФИ под действием УФО. По оси ординат отложены единицы ОП культур и ФИ, по оси абсцисс – время инкубации клеток. ФИ контрольных клеток принят за единицу

В качестве веществ, обладающих антирадикальными свойствами, нами были выбраны такие общепризнанные вещества, как аскорбиновая кислота и метилэтилпиридинол. И два синтетических фенольных антиоксиданта «Тиофан» и «Тиофан-М», обладающих двумя группами, обуславливающими их антиоксидантные и антирадикальные свойства. Антиоскидантные свойства проявляются в основном за счет содержания атома серы в структуре данных соединения [1]. Имеется работа по исследованию выживаемости клеток E.coli в условиях перекисного стресса [4], где показано, что добавление в культуральную среду производных соединений данных веществ приводило к увеличению выживаемости клеток. Антирадикальные свойства «Тиофана» и «Тиофана-М» обусловлены наличием в их структурах фенольной группировки, которая выступает «ловушкой» для радикалов, аналогично механизму, описанному для фенольного антиоксиданта 2,6-ди-трет-бутил-4-метил-фенола – «Ионол» [3]. Поэтому мы предположили, что и в наших экспериментах эти фенольные антиоксиданты должны проявить антирадикальную активность. Вещества исследовались в конечных концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл. Результаты исследования представлены в таблице.

Флуоресценция клеток с исследуемыми веществами, выраженная в процентах относительно контрольных, ФИ контрольных клеток принят за 100 % (M ± m, n = 3)

Исследуемое вещество

Концентрация исследуемого вещества

0,1 мкг/мл

1 мкг/мл

10 мкг/мл

100 мкг/мл

«Тиофан»

99,2 ± 2,7

96,7 ± 4,9

93,2 ± 3,7*

91,2 ± 1,8*

«Тиофан-М»

100,5 ± 2,1

100,8 ± 4,1

96,3 ± 4,8

90,1 ± 4,2*

Метилэтилпиридинол

98,3 ± 3,2

95,0 ± 5,8

88,7 ± 5,8*

80,3 ± 2,9*

Аскорбиновая кислота

95,6 ± 4,5

85,1 ± 5,4*

82,0 ± 4,1*

86,2 ± 4,2*

 

Примечание. * – достоверно (p < 0,05) по сравнению с контролем.

В результате этих исследований была выявлена закономерность, которая выражалась в статистически достоверном снижении флуоресценции культуры клеток при повышении концентрации исследуемого вещества. Чем выше была концентрация исследуемого вещества, тем меньше флуоресцировала культура клеток относительно контрольных. Таким образом, добавление к культурам клеток биосенсора
исследованных веществ в основном дозозависимым образом вело к снижению уровня флуоресценции культур, т.е. можно предполагать, что происходило снижение уровня повреждения ДНК клеток.

Результаты показывают, что максимальное снижение флуоресценции происходит почти на 20 % в случае метилэтилпиридинола и аскорбиновой кислоты, в случае «Тиофана» и «Тиофана-М» – почти на 10 %. Таким образом, добавление исследованных веществ к клеткам оказывало защитный эффект от УФО. Вероятно, это происходит в результате снижения концентрации свободных радикалов в клетке за счет добавленных в культуру исследованных веществ. Мы предполагаем, что данные цифры могут быть более наглядными, т.е. разница с контрольными клетками может быть большей при оптимизировании условий эксперимента. В частности, при изменении дозы УФО путем изменения времени инкубации клеток либо замены источника УФО.

Заключение

Данные результаты позволяют сделать вывод о пригодности исследуемого биосенсора для обнаружения антирадикальной активности веществ в условиях жесткого ультрафиолетового облучения клеток биосенсора. Биосенсор может быть пригоден для первичного скрининга и выявления антирадикальной активности различных, не токсичных для E.coli, веществ и может найти применение в фармакологии.

Рецензенты:

Усынин И.Ф., д.б.н., заведующий лабораторией «Молекулярная биология клетки», ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН,
г. Новосибирск;

Потеряева О.Н., д.м.н., профессор ка­федры медицинской химии, ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 31.01.2014.