Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

PEROXIDATION OF LIPIDS AND OXIDATIVE MODIFICATION OF PROTEINS OF MILK AND BLOOD OF COWS WITH PUERPERAL ENDOMETRITIS

Vysokogorskiy V.E. 1 Voronova T.D. 1 Pogorelova N.A. 1
1 FGBOU VPO «Omsk Stolypin State Agrarian University»
In the work were determined intensity of oxidative modification of proteins and peroxidation of blood lipids and milk of cows with puerperal endometritis. The intensity of free radical processes was evaluated on the following parameters: content of molecular produce of lipid peroxygenation in heptan- isopropanol extracts of milk, erythrocytes and blood plasma; oxidative modification of proteins was evaluated by the number of carbonyl groups of amino acid residues, resulting from the oxidative modification of proteins under study. Obtained results attest to variant disturbance in lipids and proteins of milk and blood of cows with postpartum endometritis. The content of final products of peroxidation of lipids (digital base) increases so in heptane as in isopropanol extracts of erythrocytes and blood plasma, the level of primary and secondary products varies in opposite directions in erythrocytes and in blood plasma. It was established the elevation of content of diene conjugate, the level of final and secondary product of peroxidation of blood lipids was unchanged. In blood plasma and milk of cows with postpartum endometritis increases the exposure of neutral aldehyde dinitrophenylhydrazine (356nm), neutral ketone dinitrophenylhydrazine (370nm). The most pronounced the stiffening in carbonylation of milk proteins at 530nm (in 3,44times).
lipid peroxidation
oxidative modification of proteins
puerperal endometritis in cows
1.Volchegorskiy I.A., Nalimov A.G., Voprosy med. khimii, 1989, no.1, pр. 127–131.
2.Vysokogorskiy V.E., Voronova T.D., Veselov Р.V., Molochnaya promyshlennost, 2009, no.10, рр. 73–74.
3.Epanchinceva O.S., Gurinov B.V., Kolupaev A.A. Omskiy nauchnyi vestnik., 2013, no.1 (118), рр. 208–213.
4.Kushnir I. Ju. Perekisnoe okislenie lipidov i antioksidantnaja zashhita organizma u vysokoproduktivnyh molochnyh korov v predrodovoj i poslerodovoj periody [Lipid peroxidation and antioxidant protection of the organism in highly productive dairy cows in prenatal and postnatal periods]. Voronezh, 2002, 180 р.
5.Makarov A.V., Tararina L.I., Molochnaya promyshlennost, 2009, no. 3, рр. 78–79.
6.Dubinina E.E., Burmistrov S.O., Hodov D.A., Porotov I.G., Voprosy. med. khimii, 1995, T. 41, no. 1, рр. 24–26.
7.Pasko N.V. Materialy mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii «Svobodnye radikaly, antioksidanty i zdorove zhivotnykh». (Materials of the international scientifically-practical conference «Free radicals, antioxidants and animal health»). Voronezh, 2004, рр. 127–130.
8.Pasko N.V. Peroksidnoe okislenie lipidov, antioksidantnaja sistema i oksid azota pri poslerodovyh narushenijah sokratitelnoj funkcii matki u korov [Lipid peroxidation, antioxidant system and nitrogen oxide with postpartum disorders contractility of the uterus in cows]. Voronezh, 2009, 144 р.
9.Pasko N.V., Materialy mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii «Aktualnye problemy veterinarnoj mediciny» (Materials of the international scientifically-practical conference «Actual problems of veterinary medicine»). Kursk, 2008, рр. 283–287.
10.Pogorelova N.A., Vysokogorskiy V.E., Strelchik N.V. Vestnik Ulyanovskoy selskohozyaystvennoy akademii, 2013, no. 4 (24), pр. 76–81.
11.Rasputina O.V., Materialy mezhdunar. nauch.-prakt. konf., posvyashhennoy 60-letiju GNU Krasnodarskogo NIVI «Aktualnye problemy veterinarii v sovremennyh usloviyah» (Materials of international scientific-practical conference devoted to 60-anniversary of the Krasnodar research veterinary Institute «Actual problems of veterinary medicine in modern conditions»). Krasnodar, 2006, рр. 366–368.
12.Rebrova O.Ju. Statisticheskiy analiz medicinskih dannyh. Primenenie paketa prikladnyh programm STATISTICA [Statistical analysis of medical data. The application of a package of applied programs STАTISTICА]. Moscow, MediaSfera, 2006. 312 р.
13.Reckij M.I. i dr. Jekologo-adaptacionnaja strategija zashhity zdorovja i produktivnosti zhivotnyh v sovremennyh uslovijah [Ecological adaptation strategy to protect the health and productivity of animals in modern conditions]. Voronezh, 2001, рр. 22–85.
14.Tararina L.I., Makarov A.V., Sarazhakova I.M., Boer I.V. Molochnaya promyshlennost, 2009, no. 4, рр. 76–77.
15.Levine R.L. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins / R.L. Levine, D. Garland, C.N. Oliver et al. // Methods Enzymol. 1990. Vol. 186. рр. 464–478.

Во время беременности, родов и по их завершении наблюдается активация процессов свободнорадикального окисления в организме сельскохозяйственных животных [13]. Значительное повышение интенсивности перекисного окисления липидов приводит к развитию акушерской патологии, которая остается одной из самых актуальных проблем ветеринарного акушерства и молочного скотоводства в целом [4].

Среди акушерской патологии в послеродовой период наиболее распространён эндометрит крупного рогатого скота [3]. При исследовании сыворотки крови установлено, что у коров, больных послеродовым гнойно-катаральным эндометритом, возрастает прооксидантная активность и снижается антиоксидантная [11, 9]. Данная патология характеризуется снижением активности важнейших ферментов антиокислительной системы (АОС) крови: супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и ферментов глутатионового звена [8]. Снижение активности анти­-
окислительной защиты приводит к активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), проявляющейся накоплением малонового диальдегида (МДА) крови, увеличением содержания флюоресцирующих оснований Шиффа (ОШ) плазмы крови [7].

Различные внешние факторы (сезон года, особенности корма), особенности физиологического состояния коров, их здоровье отражаются не только на уровне компонентов антиокислительной защиты крови, но и молока [2, 10]. В исследованиях Макарова А.В., Тарариной Л.И. (2009) выявлено увеличение ТБК-активных продуктов коров, больных послеродовым эндометритом [14, 5].

Дисбаланс про- и антиоксидантных процессов в организме, свидетельствующий о формировании оксидативного стресса, приводит к окислительной деструкции не только липидов, но и белков. Однако отсутствуют результаты исследований окислительной деструкции белков молока коров с послеродовым эндометритом. Представляется необходимым и сопоставление данных об уровне карбонильных группировок белков как плазмы крови, так и молока совместно с определением продуктов пероксидации липидов эритроцитов, плазмы и молока.

Цель данного исследования – оценить выраженность окислительной модификации белков и пероксидации липидов эритроцитов, плазмы крови и молока коров с послеродовым эндометритом.

Материалы и методы исследований

Исследования выполнены на базе хозяйств лесо-степной зоны Омской области. В работе изучали биологический материал коров черно-пестрой породы, 3–4-летнего возраста, первой половины стельности.

Все коровы были полновозрастными (2–3 лактация), животные находились в одинаковых условиях кормления (по рационам хозяйства) и содержания. Группы комплектовались по принципу аналогов (вес, период лактации, форма вымени): 1 группа (контрольная) – клинически здоровые животные; 2 группа (основная) – коровы с диагнозом «субклинический эндометрит». Разница в сроках отела не превышала 1 месяца. Кровь для биохимических исследований брали из яремной вены в утреннее время до кормления в вакуумные пробирки. Молоко охлаждали до 5 °С и хранили при этой температуре до дальнейших исследований в течение 24 часов.

Параметры липидпероксидации исследовали в гептан-изопропанольных экстрактах молока в модификации И.А. Волчегорского и др. [1]. Необходимость использования двух фаз вызвана особенностями экстрагирования, так, в гептан экстрагируются в основном нейтральные липиды, а изопропанол – фосфолипиды, которые являются важнейшими субстратами пероксидации липидов. Определяли содержание молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ): диеновых конъюгатов (ДК), кетодиенов и сопряженных триенов (КД/СТ), конечных продуктов ПОЛ – оснований Шиффа (ОШ), в каждой из экстрагируемых фаз молока спектрофотометрическим методом при 220, 232, 278 и 400 нм. Результаты выражали в единицах окислительного индекса (е.о.и.), который рассчитывали как отношение Е232/220, Е278/220, Е400/220.

Окислительную модификацию белков оценивали по Levine (1990) в модификации Е.Е. Дубининой (1995) [15, 6]. Карбонильные группировки аминокислотных остатков, образующиеся в результате окислительной модификации исследуемых белков, характеризовали степень их окислительной деструкции: нейтральные и основного характера альдегиддинитрофенилгидразоны определяли при длине 356 и 430 нм (АДФГ); а кетон-динитрофенилгидразоны нейтральные и основного характера при 370 и 530 нм соответственно (КДФГ).

Результаты обрабатывали с помощью пакета прикладных программ «Statistika 6,0»[12]. Для определения различий между независимыми группами использовали U-критерий Манна‒Уитни. Уровень отличий рассматривался как статистически значимый при вероятности ошибки Р < 0,05.

Результаты исследований
и их обсуждение

Изучение процессов СРО липидов крови было проведено с раздельной регистрацией продуктов ПОЛ эритроцитов и плазмы в гептановой и изопропанольной фазах. В гептановой фазе содержание первичных продуктов ПОЛ – диеновых конъюгатов ‒ было меньше в эритроцитах коров основной группы на 20,2 % (табл. 1), а вторичных ‒ (кетодиены и сопряжённые триены) и конечных продуктов (шиффовые основания) было выше соответствующих показателей эритроцитов контрольной группы (на 18 и 50,2 % соответственно).

Уровень конечных продуктов показал самое большое различие и в исследуемых образцах плазмы крови – шиффовых оснований в 2,1 раза больше в плазме коров больных эндометритом. Содержание изопропанолрастворимых кетодиенов, сопряжённых триенов (КД, СТ) и шиффовых оснований (ШО) в эритроцитах коров основной группы выше на 34,7 и 50,6 % соответственно в сравнении показателями здоровых животных. Выявлены изменения окисляемости липидов и в плазме крови больных коров, так, в 1,2 раза КД, СТ и в 3,4 раза ШО больше в основной группе. Содержание ДК эритроцитов и плазмы крови существенно не отличалось в основной группе животных
от контрольной.

Таким образом, наибольшие изменения в уровне содержания продуктов ПОЛ эритроцитов и плазмы крови больных животных наблюдается в отношении вторичных и конечных продуктов окислительной деструкции липидов.

При анализе молока коров двух групп животных (табл. 2) было определено более высокое содержание в молоке коров основной группы первичных продуктов ПОЛ – диеновых конъюгатов как в гептановой (на 8,2 %), так и в изопропанольной фазах (на 13,4 %).

Уровень же вторичных (кетодиены и сопряжённые триены) и конечных продуктов (шиффовые основания) в молоке больных коров существенно не отличался от данных здоровых животных.

Таблица 1

Показатели липопероксидации эритроцитов и плазмы крови коров в норме и при послеродовом эндометрите (в е.о.и.)

Показатель

Группа животных

Контрольная (n = 10)

Основная (n = 10)

Гептановая фаза

эритроциты

плазма

эритроциты

плазма

Диеновые конъюгаты

0,894 ± 0,015

0,411 ± 0,023

0,716 ± 0,091

(Р = 0,005)

0,481 ± 0,035

(Р = 0,047)

Кетодиены и сопряжённые триены

0,327 ± 0,031

0,249 ± 0,016

0,399 ± 0,052

(Р = 0,043)

0,225 ± 0,011

(Р = 0,007)

Шиффовые основания

0,136 ± 0,012

0,097 ± 0,032

0,273 ± 0,013

(Р = 0,005)

0,203 ± 0,039

(Р = 0,023)

Изопропанольная фаза

0,529 ± 0,038

0,453 ± 0,021

0,545 ± 0,024

(Р = 0,07)

0,493 ± 0,036

(Р = 0,061)

Диеновые конъюгаты

0,250 ± 0,013

0,226 ± 0,018

0,383 ± 0,015

(Р = 0,0057)

0,274 ± 0,063

(Р = 0,037)

Кетодиены и сопряжённые триены

Шиффовые основания

0,125 ± 0,075

0,057 ± 0,012

0,253 ± 0,10

(Р = 0,038)

0,193 ± 0,020

(Р = 0,0039)

 

Примечание. Значения Р представлены в сравнении с контрольной группой.

 

Таблица 2

Показатели липопероксидации молока коров в норме
и при послеродовом эндометрите (е.о.и.)

Показатель

Группа животных

Контрольная (n = 10)

Основная (n = 10)

Гептановая фаза

1,037 ± 0,039

1,130 ± 0,040

(Р = 0,048)

Диеновые конъюгаты

0,090 ± 0,010

0,093 ± 0,032

(Р = 0,628)

Кетодиены и сопряжённые триены

Шиффовые основания

0,008 ± 0,001

0,013 ± 0,0039

(Р = 0,073)

Изопропанольная фаза

0,433 ± 0,018

0,500 ± 0,049

(Р = 0,047)

Диеновые конъюгаты

0,205 ± 0,026

0,240 ± 0,024

(Р = 0,062)

Кетодиены и сопряжённые триены

Шиффовые основания

0,038 ± 0,036

0,023 ± 0,010

(Р = 0,356)

 

Примечание. Значения Р представлены в сравнении с контрольной группой.

Таблица 3

Показатели карбонилирования белков плазмы крови коров в норме
и при послеродовом эндометрите (е.о.п. на 1 мл плазмы)

Показатель

Группа животных

Контрольная (n = 10)

Основная (n = 10)

Алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны, (356 нм)

6,52 ± 0,62

7,37 ± 0,74

(Р = 0,017)

Алифатические кетондинитрофенилгидразоны,
(370 нм)

6,40 ± 0,18

7,40 ± 0,36

(Р = 0,026)

Альдегиддинитрофенилгидразоны основного характера, (430 нм)

3,37 ± 0,09

3,60 ± 0,10

(Р = 0,378)

Кетондинитрофенилгидразоны основного характера, (530 нм)

0,34 ± 0,09

0,51 ± 0,02

(Р = 0,015)

 

Примечание. Значения Р представлены в сравнении с контрольной группой.

Активация СРО липидов эритроцитов и плазмы крови сопровождается увеличением карбонильных производных белков плазмы больных животных (табл. 3), о чем свидетельствует повышение среднего уровня алифатических альдегиддинитрофенилгидразонов и кетондинитрофенилгидразонов на 11,5 и 13,5 %. Содержание кетондинитрофенилгидразонов основного характера плазмы крови в группе больных коров с послеродовым эндометритом выше на 32,7 % по сравнению со здоровыми
животными.

Свободные радикалы могут вызывать окислительную деструкцию не только белков крови, но и белков молока (табл. 4), поэтому далее определяли количество карбонильных соединений белка сырого молока, основную часть которых составляют альдегидо- и кетонпроизводные нейтрального характера. Нами установлено повышение уровня алифатических альдегиддинитрофенилгидразонов нейтрального характера на 28,8 % (р = 0,0047) и кетондинитрофенилгидразонов на 78 % (р = 0,008) у коров больных послеродовым эндометритом по сравнению с контрольной группой. Выявлено повышение и кетондинитрофенилгидразонов основного характера, определяемых при 530 нм, в сыром молоке коров основной группы в 3,44 раз по сравнению со здоровыми животными (р = 0,029).

Таблица 4

Показатели карбонилирования белков молока коров в норме и при послеродовом эндометрите (е.о.п. на 1 мл молока)

Показатель

Группа животных

Контрольная (n = 10)

Основная (n = 10)

Алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны,
(356 нм)

3,19 ± 0,195

4,11 ± 0,612

(Р = 0,005)

Алифатические кетондинитрофенилгидразоны (370 нм)

2,86 ± 0,232

3,67 ± 0,570

(Р = 0,008)

Альдегиддинитрофенилгидразоны основного характера, (430 нм)

1,34 ± 0,560

1,55 ± 0,647

(Р = 0,491)

Кетондинитрофенилгидразоны основного характера (530 нм)

0,148 ± 0,028

0,508 ± 0,145

(Р = 0,029)

 

Примечание. Значения Р представлены в сравнении с контрольной группой.

Полученные результаты свидетельствуют о значительных свободнорадикальных нарушениях белков молока коров, больных послеродовым эндометритом, в меньшей степени эти изменения выявлены в уровне содержания продуктов ПОЛ молока.

Заключение

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о различных нарушениях свободнорадикальных процессов липидов и белков молока коров больных послеродовым эндометритом. Следует отметить, что конечные продукты пероксидации липидов (шиффовые основания) увеличиваются как в гептановом, так и изопропанольном экстрактах эритроцитов и плазмы крови, а уровень первичных и вторичных продуктов изменяется в противоположных направлениях в эритроцитах и в плазме крови. В противоположность показателям крови содержание конечных и вторичных продуктов пероксидации липидов молока не изменяется, отмечается только некоторое повышение диеновых конъюгатов. В плазме крови и молоке коров, больных послеродовым эндометритом, возрастает содержание как ранних маркёров окислительной деструкции белков – нейтральных альдегиддинитрофенилгидразонов, так и поздних – нейтральных кетондинитрофенилгидразонов. Наиболее выражено повышение уровня карбонилирования белков молока при 530 нм (в 3,44 раза).

Рецензенты:

Конвай В.Д., д.м.н., профессор кафедры химии, ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет
им. П.А. Столыпина», г. Омск;

Степанова И.П., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой химии, ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, г. Омск.

Работа поступила в редакцию 31.01.2014.