Во время беременности, родов и по их завершении наблюдается активация процессов свободнорадикального окисления в организме сельскохозяйственных животных [13]. Значительное повышение интенсивности перекисного окисления липидов приводит к развитию акушерской патологии, которая остается одной из самых актуальных проблем ветеринарного акушерства и молочного скотоводства в целом [4].
Среди акушерской патологии в послеродовой период наиболее распространён эндометрит крупного рогатого скота [3]. При исследовании сыворотки крови установлено, что у коров, больных послеродовым гнойно-катаральным эндометритом, возрастает прооксидантная активность и снижается антиоксидантная [11, 9]. Данная патология характеризуется снижением активности важнейших ферментов антиокислительной системы (АОС) крови: супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и ферментов глутатионового звена [8]. Снижение активности анти-
окислительной защиты приводит к активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), проявляющейся накоплением малонового диальдегида (МДА) крови, увеличением содержания флюоресцирующих оснований Шиффа (ОШ) плазмы крови [7].
Различные внешние факторы (сезон года, особенности корма), особенности физиологического состояния коров, их здоровье отражаются не только на уровне компонентов антиокислительной защиты крови, но и молока [2, 10]. В исследованиях Макарова А.В., Тарариной Л.И. (2009) выявлено увеличение ТБК-активных продуктов коров, больных послеродовым эндометритом [14, 5].
Дисбаланс про- и антиоксидантных процессов в организме, свидетельствующий о формировании оксидативного стресса, приводит к окислительной деструкции не только липидов, но и белков. Однако отсутствуют результаты исследований окислительной деструкции белков молока коров с послеродовым эндометритом. Представляется необходимым и сопоставление данных об уровне карбонильных группировок белков как плазмы крови, так и молока совместно с определением продуктов пероксидации липидов эритроцитов, плазмы и молока.
Цель данного исследования – оценить выраженность окислительной модификации белков и пероксидации липидов эритроцитов, плазмы крови и молока коров с послеродовым эндометритом.
Материалы и методы исследований
Исследования выполнены на базе хозяйств лесо-степной зоны Омской области. В работе изучали биологический материал коров черно-пестрой породы, 3–4-летнего возраста, первой половины стельности.
Все коровы были полновозрастными (2–3 лактация), животные находились в одинаковых условиях кормления (по рационам хозяйства) и содержания. Группы комплектовались по принципу аналогов (вес, период лактации, форма вымени): 1 группа (контрольная) – клинически здоровые животные; 2 группа (основная) – коровы с диагнозом «субклинический эндометрит». Разница в сроках отела не превышала 1 месяца. Кровь для биохимических исследований брали из яремной вены в утреннее время до кормления в вакуумные пробирки. Молоко охлаждали до 5 °С и хранили при этой температуре до дальнейших исследований в течение 24 часов.
Параметры липидпероксидации исследовали в гептан-изопропанольных экстрактах молока в модификации И.А. Волчегорского и др. [1]. Необходимость использования двух фаз вызвана особенностями экстрагирования, так, в гептан экстрагируются в основном нейтральные липиды, а изопропанол – фосфолипиды, которые являются важнейшими субстратами пероксидации липидов. Определяли содержание молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ): диеновых конъюгатов (ДК), кетодиенов и сопряженных триенов (КД/СТ), конечных продуктов ПОЛ – оснований Шиффа (ОШ), в каждой из экстрагируемых фаз молока спектрофотометрическим методом при 220, 232, 278 и 400 нм. Результаты выражали в единицах окислительного индекса (е.о.и.), который рассчитывали как отношение Е232/220, Е278/220, Е400/220.
Окислительную модификацию белков оценивали по Levine (1990) в модификации Е.Е. Дубининой (1995) [15, 6]. Карбонильные группировки аминокислотных остатков, образующиеся в результате окислительной модификации исследуемых белков, характеризовали степень их окислительной деструкции: нейтральные и основного характера альдегиддинитрофенилгидразоны определяли при длине 356 и 430 нм (АДФГ); а кетон-динитрофенилгидразоны нейтральные и основного характера при 370 и 530 нм соответственно (КДФГ).
Результаты обрабатывали с помощью пакета прикладных программ «Statistika 6,0»[12]. Для определения различий между независимыми группами использовали U-критерий Манна‒Уитни. Уровень отличий рассматривался как статистически значимый при вероятности ошибки Р < 0,05.
Результаты исследований
и их обсуждение
Изучение процессов СРО липидов крови было проведено с раздельной регистрацией продуктов ПОЛ эритроцитов и плазмы в гептановой и изопропанольной фазах. В гептановой фазе содержание первичных продуктов ПОЛ – диеновых конъюгатов ‒ было меньше в эритроцитах коров основной группы на 20,2 % (табл. 1), а вторичных ‒ (кетодиены и сопряжённые триены) и конечных продуктов (шиффовые основания) было выше соответствующих показателей эритроцитов контрольной группы (на 18 и 50,2 % соответственно).
Уровень конечных продуктов показал самое большое различие и в исследуемых образцах плазмы крови – шиффовых оснований в 2,1 раза больше в плазме коров больных эндометритом. Содержание изопропанолрастворимых кетодиенов, сопряжённых триенов (КД, СТ) и шиффовых оснований (ШО) в эритроцитах коров основной группы выше на 34,7 и 50,6 % соответственно в сравнении показателями здоровых животных. Выявлены изменения окисляемости липидов и в плазме крови больных коров, так, в 1,2 раза КД, СТ и в 3,4 раза ШО больше в основной группе. Содержание ДК эритроцитов и плазмы крови существенно не отличалось в основной группе животных
от контрольной.
Таким образом, наибольшие изменения в уровне содержания продуктов ПОЛ эритроцитов и плазмы крови больных животных наблюдается в отношении вторичных и конечных продуктов окислительной деструкции липидов.
При анализе молока коров двух групп животных (табл. 2) было определено более высокое содержание в молоке коров основной группы первичных продуктов ПОЛ – диеновых конъюгатов как в гептановой (на 8,2 %), так и в изопропанольной фазах (на 13,4 %).
Уровень же вторичных (кетодиены и сопряжённые триены) и конечных продуктов (шиффовые основания) в молоке больных коров существенно не отличался от данных здоровых животных.
Таблица 1
Показатели липопероксидации эритроцитов и плазмы крови коров в норме и при послеродовом эндометрите (в е.о.и.)
|
Показатель |
Группа животных |
|||
|
Контрольная (n = 10) |
Основная (n = 10) |
|||
|
Гептановая фаза |
эритроциты |
плазма |
эритроциты |
плазма |
|
Диеновые конъюгаты |
0,894 ± 0,015 |
0,411 ± 0,023 |
0,716 ± 0,091 (Р = 0,005) |
0,481 ± 0,035 (Р = 0,047) |
|
Кетодиены и сопряжённые триены |
0,327 ± 0,031 |
0,249 ± 0,016 |
0,399 ± 0,052 (Р = 0,043) |
0,225 ± 0,011 (Р = 0,007) |
|
Шиффовые основания |
0,136 ± 0,012 |
0,097 ± 0,032 |
0,273 ± 0,013 (Р = 0,005) |
0,203 ± 0,039 (Р = 0,023) |
|
Изопропанольная фаза |
0,529 ± 0,038 |
0,453 ± 0,021 |
0,545 ± 0,024 (Р = 0,07) |
0,493 ± 0,036 (Р = 0,061) |
|
Диеновые конъюгаты |
0,250 ± 0,013 |
0,226 ± 0,018 |
0,383 ± 0,015 (Р = 0,0057) |
0,274 ± 0,063 (Р = 0,037) |
|
Кетодиены и сопряжённые триены |
||||
|
Шиффовые основания |
0,125 ± 0,075 |
0,057 ± 0,012 |
0,253 ± 0,10 (Р = 0,038) |
0,193 ± 0,020 (Р = 0,0039) |
Примечание. Значения Р представлены в сравнении с контрольной группой.
Таблица 2
Показатели липопероксидации молока коров в норме
и при послеродовом эндометрите (е.о.и.)
|
Показатель |
Группа животных |
|
|
Контрольная (n = 10) |
Основная (n = 10) |
|
|
Гептановая фаза |
1,037 ± 0,039 |
1,130 ± 0,040 (Р = 0,048) |
|
Диеновые конъюгаты |
0,090 ± 0,010 |
0,093 ± 0,032 (Р = 0,628) |
|
Кетодиены и сопряжённые триены |
||
|
Шиффовые основания |
0,008 ± 0,001 |
0,013 ± 0,0039 (Р = 0,073) |
|
Изопропанольная фаза |
0,433 ± 0,018 |
0,500 ± 0,049 (Р = 0,047) |
|
Диеновые конъюгаты |
0,205 ± 0,026 |
0,240 ± 0,024 (Р = 0,062) |
|
Кетодиены и сопряжённые триены |
||
|
Шиффовые основания |
0,038 ± 0,036 |
0,023 ± 0,010 (Р = 0,356) |
Примечание. Значения Р представлены в сравнении с контрольной группой.
Таблица 3
Показатели карбонилирования белков плазмы крови коров в норме
и при послеродовом эндометрите (е.о.п. на 1 мл плазмы)
|
Показатель |
Группа животных |
|
|
Контрольная (n = 10) |
Основная (n = 10) |
|
|
Алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны, (356 нм) |
6,52 ± 0,62 |
7,37 ± 0,74 (Р = 0,017) |
|
Алифатические кетондинитрофенилгидразоны, |
6,40 ± 0,18 |
7,40 ± 0,36 (Р = 0,026) |
|
Альдегиддинитрофенилгидразоны основного характера, (430 нм) |
3,37 ± 0,09 |
3,60 ± 0,10 (Р = 0,378) |
|
Кетондинитрофенилгидразоны основного характера, (530 нм) |
0,34 ± 0,09 |
0,51 ± 0,02 (Р = 0,015) |
Примечание. Значения Р представлены в сравнении с контрольной группой.
Активация СРО липидов эритроцитов и плазмы крови сопровождается увеличением карбонильных производных белков плазмы больных животных (табл. 3), о чем свидетельствует повышение среднего уровня алифатических альдегиддинитрофенилгидразонов и кетондинитрофенилгидразонов на 11,5 и 13,5 %. Содержание кетондинитрофенилгидразонов основного характера плазмы крови в группе больных коров с послеродовым эндометритом выше на 32,7 % по сравнению со здоровыми
животными.
Свободные радикалы могут вызывать окислительную деструкцию не только белков крови, но и белков молока (табл. 4), поэтому далее определяли количество карбонильных соединений белка сырого молока, основную часть которых составляют альдегидо- и кетонпроизводные нейтрального характера. Нами установлено повышение уровня алифатических альдегиддинитрофенилгидразонов нейтрального характера на 28,8 % (р = 0,0047) и кетондинитрофенилгидразонов на 78 % (р = 0,008) у коров больных послеродовым эндометритом по сравнению с контрольной группой. Выявлено повышение и кетондинитрофенилгидразонов основного характера, определяемых при 530 нм, в сыром молоке коров основной группы в 3,44 раз по сравнению со здоровыми животными (р = 0,029).
Таблица 4
Показатели карбонилирования белков молока коров в норме и при послеродовом эндометрите (е.о.п. на 1 мл молока)
|
Показатель |
Группа животных |
|
|
Контрольная (n = 10) |
Основная (n = 10) |
|
|
Алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны, |
3,19 ± 0,195 |
4,11 ± 0,612 (Р = 0,005) |
|
Алифатические кетондинитрофенилгидразоны (370 нм) |
2,86 ± 0,232 |
3,67 ± 0,570 (Р = 0,008) |
|
Альдегиддинитрофенилгидразоны основного характера, (430 нм) |
1,34 ± 0,560 |
1,55 ± 0,647 (Р = 0,491) |
|
Кетондинитрофенилгидразоны основного характера (530 нм) |
0,148 ± 0,028 |
0,508 ± 0,145 (Р = 0,029) |
Примечание. Значения Р представлены в сравнении с контрольной группой.
Полученные результаты свидетельствуют о значительных свободнорадикальных нарушениях белков молока коров, больных послеродовым эндометритом, в меньшей степени эти изменения выявлены в уровне содержания продуктов ПОЛ молока.
Заключение
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о различных нарушениях свободнорадикальных процессов липидов и белков молока коров больных послеродовым эндометритом. Следует отметить, что конечные продукты пероксидации липидов (шиффовые основания) увеличиваются как в гептановом, так и изопропанольном экстрактах эритроцитов и плазмы крови, а уровень первичных и вторичных продуктов изменяется в противоположных направлениях в эритроцитах и в плазме крови. В противоположность показателям крови содержание конечных и вторичных продуктов пероксидации липидов молока не изменяется, отмечается только некоторое повышение диеновых конъюгатов. В плазме крови и молоке коров, больных послеродовым эндометритом, возрастает содержание как ранних маркёров окислительной деструкции белков – нейтральных альдегиддинитрофенилгидразонов, так и поздних – нейтральных кетондинитрофенилгидразонов. Наиболее выражено повышение уровня карбонилирования белков молока при 530 нм (в 3,44 раза).
Рецензенты:
Конвай В.Д., д.м.н., профессор кафедры химии, ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет
им. П.А. Столыпина», г. Омск;
Степанова И.П., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой химии, ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, г. Омск.