Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

ANALYSIS AND VALIDATION TECHNIQUE’S VALUATION OF QUANTITATIVE ACTIVE SUBSTANCE’S DEFINITION IN EXTERNAL DOSAGE FORM WITH ANTICACATRICAL EFFECT

Zhidkova U.U. 1 Penyevskaya N.А. 1 Voronkov A.V. 2 Zaytsev V.P. 2 Uschakova L.S. 2 Leonova V.N. 2 Mezenova T.D. 2
1 Omsk State Medical Academy
2 Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute
It was developed the composite gel with anticacatrical effect, active components of which are meglumine acridonacetate (cycloferon), glycyram and rosehip oil. Identification and quantitative definition of glycyram in gel was employed a method of thin-layer chromatography with subsequent densimetric chromatogram’s processing (by method of absolute calibration by calibrating graph of substance weight – area relationship (linear approximation)). It was made a validation of developed method. It was determined parameters of linearity (calibrating graph described by equation: S = (7,5 ± 0,8)∙103 m, coefficient of correlation r = 0,997), accuracy (determined by method «introduced-found», average percent of openness – 102,8 %) and repeatability of developed technique (estimated by result of repeated content’s determination glycyram’s in gel). It was made determination of chromatographic description. Derived results testify to enough specific, high sensibility and efficiency of chromatographic method.
gel
meglumine acridonacetate (cycloferon)
glycyram
rosehip oil
1. FSP 42-0320-1700-06 Tsikloferon, rastvor dlya vnutrennego i vnutrimyshechnogo vvedeniya 125 mg/ml. Izmenenie no. 2. Vved. 2010.05.03. OOO NTFF «Polisan», Russia, 2010. 10 p.
2 SP 42-1702-07 Tsikloferon, liniment 5 %. Vved. 2008.14.03. OOO NTFF «Polisan», Russia, 2008. 10 p.
3. Kachestvennyy i kolichestvennyy analiz syrya i preparatov solodki. M.V. Egorov [i dr.]. Vestnik VGU. Seriya: Khimiya. Biologiya. Farmatsiya. 2005, no. 1, pp. 175–180.
4. FS 42-2067-95 «Maslo shipovnika». Vved. 1995.08.11. MZ RF Farmakopeynyy gos. komitet, Russia, 1995. 6 р.
5 Krasikov V.D. Оsnovy planarnoy khromatografii [The basis of the plan chromatography]. SPb., Chimizdat, 2005, рp. 106.

Одной из важных задач, определяющих границу между дерматологией и космецевтикой, является лечение и профилактика келоидных и гипертрофических рубцов.

Хирургическое лечение не всегда обеспечивает желаемые результаты. Поэтому комплексная терапия с использованием наружных лекарственных форм является перспективной. В связи с этим нами предлагается гель с меглумина акридонацетатом (циклофероном), глицирамом и маслом шиповника, обеспечивающий по предварительным исследованиям противорубцовый эффект.

Цель исследования – разработка методики идентификации и количественного определения глицирама в геле, содержащем кроме глицирама меглумина акридонацетат (циклоферон) и масло шиповника.

Результаты исследования и их обсуждение

Циклоферон, глицирам и масло шиповника имеют близкие максимумы светопоглощения в УФ области [1, 2, 3, 4], поэтому непосредственно каждое лекарственное вещество методом УФ-спектрофотометрии идентифицировать и количественно определить не представлялось возможным. В связи с этим нами была разработана методика идентификации и количественного определения глицирама методом тонкослойной хроматографии с последующей денситометрической обработкой хроматограмм.

Приготовление раствора геля. Около 0,5 г (точная навеска) геля помещали в коническую колбу вместимостью 50 мл, приливали 5 мл спирта этилового 95 %, тщательно перемешивали. Полученное извлечение отфильтровывали (фильтр «желтая лента») в мерную колбу вместимостью 25 мл. Далее в коническую колбу приливали новую порцию спирта этилового 95 % объёмом примерно 5 мл, взбалтывали и переносили на фильтр. Операцию повторяли еще трижды. Все извлечения собирали в мерную колбу. Раствор в мерной колбе доводили спиртом до метки, тщательно перемешивали. Раствор использовали для дальнейшего анализа.

Приготовление рабочего стандартного образца (РСО) глицирама. В качестве рабочего стандартного образца использовали субстанцию глицирама (ФСП 42-8145-06). 0,025 г (точная навеска) РСО глицирама помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в небольшом объеме спирта этилового 95 %, перемешивали до растворения. Раствор доводили спиртом этиловым 95 % до метки, тщательно перемешивали. Концентрация полученного раствора 1 мкг/мкл.

Методика идентификации и количественного определения глицирама в геле

Хроматографирование проводили на пластинках марки «Sorbfil ПТСХ-АФ-В-УФ» размером 10×15 см. В качестве подвижной фазы использовали систему н-бутанол – спирт этиловый 95 % – концентрированный раствор аммиака (6:1:3). Для детектирования нами предложено использовать 50 % раствор серной кислоты. Линию старта обозначали на расстоянии 1,5 см от края пластинки длиною 15 см.

На линию старта хроматографической пластинки наносили 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мкл раствора РСО с содержанием глицирама 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мкг соответственно. На этой же пластинке обозначали 4 линии контрольных треков, куда наносили по 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мкл спиртового извлечения геля. Пробы наносили при помощи микрошприца М-10Н. Пластинки помещали в камеру для хроматографирования. Высота подъема растворителя 8 см. Пластинки вынимали, высушивали при комнатной температуре, обрабатывали детектирующим реактивом методом опрыскивания и выдерживали в сушильном шкафу при температуре 100–105 °С в течение 30 мин. Наблюдали появление коричневых пятен. Пластинки сканировали при помощи планшетного сканера hp scanjet 3670 (разрешение 100 dpi) и далее осуществляли их цифровую обработку с помощью компьютерной программы «Видеоденситометр Sorbfil» (г. Краснодар). Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по градуировочному графику зависимости «масса вещества – площадь пика» (линейная аппроксимация).

Определение хроматографических характеристик

Чувствительность аналитической реакции на пластинке, установленная по величине открываемого минимума (предела обнаружения) (мкг), которая визуально проявлялась после детектирования, составила 1 мкг глицирама в пятне.

Идентификацию глицирама в спиртовом извлечении из геля проводили по величине Rf пятна контрольного трека, которая соответствует Rf пятна стандартного образца (0,13 ± 0,01) (рис. 1, 2).

Эффективность пластинки определяли по числу теоретических тарелок пятен стандартных образцов. Данный показатель для глицирама составил около 250 теоретических тарелок. Полученные результаты свидетельствуют о достаточной чувствительности и эффективности хроматографической методики.

Для валидации методики количественного анализа определяли линейность, правильность и сходимость.

Линейность устанавливали по градуировочному графику, полученному при компьютерной обработке хроматограмм в координатах площадь пика (S) – масса (m, мкг). Под площадью пика в видеоденситометрии понимается интегральная характеристика, включающая собственно площадь пятна, его объём в пространстве и интенсивность его окраски [5]. Для этой цели использовали раствор РСО глицирама с концентрацией 1 мкг/мкл. Хроматограмму готовили, как указано выше. Диапазон масс глицирама в пятнах 1,0–5,0 мкг. По данным градуировочного графика рассчитывали статистические характеристики и коэффициент корреляции. Методом наименьших квадратов определяли значимость свободного члена линейной зависимости (а), величину углового коэффициента (b). Расчеты проводили с помощью программы Microsoft Excel. Градуировочный график описывается уравнением S = (7,5 ± 0,8)∙103 m, коэффициент корреляции r = 0,997.

Правильность методики определяли методом «введено – найдено». По градуировочному графику рассчитывали содержание глицирама на 5-ти уровнях концентраций стандартного образца и рассчитывали метрологические характеристики. Результаты приведены в табл. 1.

pic_56.tif

Рис. 1. Хроматограмма РСО глицирама

pic_57.tif

Рис. 2. Хроматограмма спиртового извлечения геля с глицирамом: 1 – глицирам

pic_58.tif

Рис. 3. Градуировочный график глицирама

Таблица 1

Оценка правильности определения глицирама

Уровень

Введено, мкг

Найдено, мкг

Открываемость, %

Метрологические характеристики

1

1,0

1,02

102

Хср = 102,8

SD = 9,36

RSD = 9,1 %

Е = 8,0 %

2

2,0

2,3

115

3

3,0

3,06

102

4

4,0

3,56

89

5

5,0

5,3

106

Сходимость методики оценивали по результатам повторных определений содержания глицирама в геле. Результаты и метрологические характеристики представлены в табл. 2.

Таблица 2

Результаты определения глицирама в геле. Оценка сходимости

Содержание глицирама в геле, г/100 г

Метрологические характеристики

4,2

Хср = 4,91

DХ = 0,43

SD = 0,467

RSD % = 9,5 %

Е % = 8,8 %

4,5

4,6

5,2

5,3

5,3

5,3

Выводы

1. Методом тонкослойной хроматографии с последующей денситометрической обработкой хроматограмм был идентифицирован и количественно определен глицирам в геле противорубцового действия.

2. Установлены параметры линейности, правильности и сходимости разработанной методики определения глицирама.

Рецензенты:

Власова И.В., д.х.н., доцент, профессор кафедры аналитической химии, ФГБОУ ВПО «Омский государственный университет им. Ф.М. Достоевского», г. Омск;

Андреева И.Н., д.фарм.н., профессор кафедры «Туризм», Институт сервиса и технологий, филиал ФГОУ ВПО «ДГТУ», г. Пятигорск.

Работа поступила в редакцию 17.10.2013.