Несмотря на огромное количество работ в области применения гипотермии при операциях на магистральных сосудах, головном мозге, органах грудной клетки как метода подавления избыточных реакций организма на оперативное вмешательство, предупреждения развития тяжелой гипоксии и повышения устойчивости головного мозга к кислородному голоданию [9–11, 19, 21, 23], механизмы, лежащие в основе протективных механизмов гипотермии при ишемических/гипоксических повреждениях мозга, изучены недостаточно.
Патофизиологической основой развития ишемического и реперфузионного повреждений мозга является нарушение кровоснабжения мозга [15–16]. Ишемия мозга провоцирует энергетическое голодание мозговой ткани, повреждение мембран клеток мозга вследствие высокой реактивности свободных радикалов в мозге. В результате данных изменений в нейронах и глиальных клетках головного мозга нарушаются процессы рецепторного связывания [3–4, 13]. Также ишемические и реперфузионные изменения мозга способствует аккумуляции повреждений структуры ДНК в результате окислительного стресса, что в дальнейшем приводит к запуску процесса гибели клетки [20]. Каскад реакций, сопровождающих ишемические/реперфузионные повреждения мозга, сопровождаются гипертермией, что усугубляет степень повреждений нейронов мозга [22].
В то же время умеренная гипотермия на фоне или сразу после церебральной ишемии оказывает нейропротективное действие за счет снижения окислительных повреждений ДНК и структурных элементов мембраны клетки [18], повышения выживаемости нейронов в результате понижения активности проапоптотических и некротических факторов [24]. Таким образом, температура мозга является одним из наиболее значимых факторов, определяющих функциональное состояние мозга.
В связи с вышесказанным в экспериментальных моделях и клинических испытаниях важна разработка комбинированной патофизиологически значимой терапии с количественной оценкой обратимости повреждений вещества мозга при ишемии/гипоксии [8]. Таким образом, применение сочетанного действия умеренной гипотермии и препаратов-нейропротекторов на фоне нарушения мозгового кровообращения является актуальным в решения вопроса эффективности снижения последствий ишемического/реперфузионного повреждения мозга. В этой связи актуальным является исследование эффектов ноотропных препаратов и гипотермии при ишемизации мозга.
Целью данного исследования явилось изучение влияния умеренной гипотермии и введения церебрамина на показатели свободнорадикального окисления в мозге крыс, подвергнутых двусторонней окклюзии сонных артерий.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования служили 128 белых беспородных половозрелых крыс-самцов в возрасте 6-ти месяцев, массой 200–250 г. Животных содержали в условиях вивария при температуре +18–20 °С на стандартном рационе питания. Для избежания сезонных колебаний метаболизма и регуляции функций, опыты проводили в зимние месяцы: декабрь – февраль.
Животные были разделены на следующие группы: 1-я группа – ложнооперированные крысы (л/о, контрольная группа, n = 16). 2-я группа – животные, которым проводили перевязку правой сонной артерии (ПСА) на 3 минуты (с последующей 24-часовой реоксигенацией) и левой сонной артерии (ЛСА) на 24 часа (n = 16). 3-я группа – животные, которым перорально (per os) вводили церебрамин в течение 5 суток в (кормление 1 раз в сутки в утренние часы) в дозе 0,5 мг/кг с последующим проведением ложной операции (n = 16). 4-я группа – животные, которым перед проведением 3-минутной окклюзии ПСА и 24-часовой окклюзии ЛСА перорально вводили церебрамин в дозе 0,5 мг/кг в течение 5 суток (n = 16). 5-я группа – животные, которых после проведения ложной операции помещали в холодовую камеру с охлаждаемой водяной рубашкой, конструкция которой позволяла регулировать уровень охлаждения и непрерывно фиксировать термодатчиком ректальную температуру тела животного с точностью до 0,010 °С (n = 16). 6-я группа – животные, которых после проведения 3-минутной окклюзии ПСА и 24-часовой окклюзии ЛСА помещали в холодовую камеру (n = 16). 7-я группа – животные, которым перорально вводили церебрамин в течение 5 суток. После проведения ложной операции крыс помещали в холодовую камеру (n = 16). 8-я группа – животные, которым перед проведением 3-минутной окклюзии ПСА и 24-часовой окклюзии ЛСА перорально вводили церебрамин в дозе 0,5 мг/кг в течение 5 суток. После проведения операции крыс помещали в холодовую камеру (n = 16).
Через 24 часа после операций животных декапитировали, мозг извлекали на холоде и выделяли кору и стволовые структуры. Ишемизацию мозга моделировали путем перевязки левой сонной артерии на 24 часа и через минуту правой сонной артерии на 3 минуты с последующей 24-часовой реоксигенацией [2]. Гипотермию моделировали путем помещения животных 5–7 групп в холодовые камеры до тех пор, пока ректальная температура крысы не опускалась до 30 °С (умеренная гипотермия). Температура воды в водяной рубашке составляла 8 °С.
Содержание ТБК-реактивных продуктов определяли флюориметрическм методом, описанным А.В. Арутюнян и др. [1]. Активность глутатионпероксидазы определяли по скорости окисления восстановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила по методу [17]. Определение концентрации ВГ проводили методом G.L. Ellman [14]. Активность глутатионредуктазы определяли по скорости окисления НАДФН2 методом [12]. Определение активности глутатион-S-трансферазы проводили по методу, описанному в пособии [6]. Активность каталазы определяли методом М.А. Королюка.
Результатов исследования и их обсуждение
В табл. 1–2 представлены результаты исследования состояния про- и антиоксидантного статуса в мозге экспериментальных животных. В модели окклюзии сонных артерий (2 группа) выявлено накопление гидроперекисей липидов и ТБК-реактивных продуктов в мозге крыс на фоне повышения активности ГПО и ГТ, а также снижения содержания ВГ по сравнению с контролем. Кроме того, показано снижение активности ГР в коре больших полушарий относительно контрольной группы. Следовательно, в условиях окклюзии сонных артерий недостаточная активация ферментов, восстанавливающих образующиеся гидроперекиси липидов, способствует накоплению вторичных продуктов свободнорадикальных процессов (СРП) в структурах мозга животных. Вероятно, это наблюдается по причине снижения синтеза ВГ и активности ГР в клетках в условиях развивающегося ацидоза при ишемии мозга.
Таблица 1
Влияние церебрамина и гипотермии на содержание гидроперекисей липидов, ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП), восстановленного глутатиона (ВГ), активность каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионредуктазы (ГР) в коре больших полушарий крыс, (M ± m)
|
Группы |
Гидроперекиси липидов |
ТБК-РП, нмоль/мг белка |
ГПО, мкмоль/мин/г белка |
ВГ, мкмоль/г ткани |
ГТ, ммоль/мин/г |
ГР, мкмоль/мин/г белка |
Каталазная активность, ммоль/мин/г белка |
|
1. контроль |
89,02 ± 3,51 |
24,35 ± 1,23 |
20,79 ± 0,87 |
0,15 ± 0,02 |
6,82 ± 0,83 |
19,80 ± 0,74 |
2,94 ± 0,09 |
|
2. ОСА |
145,34 ± 6,75* |
39,64 ± 1,43* |
25,92 ± 1,12* |
0,11 ± 0,05* |
9,46 ± 0,31 |
12,75 ± 0,59* |
3,75 ± 0,11* |
|
3. Церебрамин + л/о |
102,54 ± 5,01 |
33,42 ± 1,21* |
26,75 ± 1,03* |
0,19 ± 0,007* |
8,30 ± 0,42* |
23,17 ± 0,52 |
3,97 ± 0,12* |
|
4. Церебрамин + ОСА |
124,75 ± 5,29 |
29,47 ± 1,16* |
27,92 ± 1,34* |
0,13 ± 0,006 |
9,79 ± 0,45* |
14,38 ± 0,64* |
3,61 ± 0,13* |
|
5. л/о + гипотермия |
133,93 ± 6,91* |
32,38 ± 1,45* |
21,59 ± 0,09 |
0,12 ± 0,005* |
6,03 ± 0,27 |
13,22 ± 0,61* |
2,46 ± 0,10 |
|
6. ОСА + гипотермия |
120,60 ± 5,72* |
28,51 ± 1,06 |
26,17 ± 1,11* |
0,09 ± 0,004* |
8,32 ± 0,40* |
11,53 ± 0,49* |
3,25 ± 0,12 |
|
7. Церебрамин + л/о + гипотермия |
95,35 ± 4,24 |
26,58 ± 1,20 |
24,55 ± 1,21 |
0,18 ± 0,007 |
6,26 ± 0,23 |
18,36 ± 0,09 |
3,42 ± 0,13 |
|
8. Церебрамин + ОСА + гипотермия |
113,52 ± 5,63* |
28,29 ± 1,13 |
18,04 ± 0,08 |
0,17 ± 0,03 |
7,13 ± 0,29 |
16,04 ± 0,05* |
3,04 ± 0,14 |
Примечание. * достоверные (р < 0,05) отличия показателей относительно контрольных значений.
Таблица 2
Влияние церебрамина и гипотермии на содержание гидроперекисей липидов, ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП), восстановленного глутатиона (ВГ), активность каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионредуктазы (ГР) в стволовых структурах мозга крыс, (M ± m)
|
Группы |
Гидроперекиси липидов |
ТБК-РП, нмоль/мгбелка |
ГПО, мкмоль/мин/г белка |
ВГ, мкмоль/г ткани |
ГТ, ммоль/мин/г |
ГР, мкмоль/мин/г белка |
Каталазная активность, ммоль/мин/г белка |
|
1. контроль |
95,64 ± 4,38 |
31,55 ± 1,72 |
46,83 ± 1,39 |
0,13 ± 0,01 |
10,64 ± 0,45 |
14,19 ± 1,06 |
2,97 ± 0,15 |
|
2. ОСА |
138,83 ± 6,09* |
42,78 ± 2,11* |
58,72 ± 2,33* |
0,08 ± 0,003* |
15,83 ± 0,71* |
15,04 ± 0,61 |
3,42 ± 0,11 |
|
3. Церебрамин + л/о |
112,06 ± 0,47 |
35,41 ± 1,66 |
49,70 ± 2,31 |
0,17 ± 0,005* |
16,44 ± 0,68* |
16,62 ± 0,58* |
3,78 ± 0,12* |
|
4. Церебрамин + ОСА |
132,75 ± 0,55* |
37,59 ± 1,52* |
54,11 ± 2,49* |
0,10 ± 0,004* |
14,29 ± 0,59* |
17,38 ± 0,83* |
3,29 ± 0,10 |
|
5. л/о + гипотермия |
143,89 ± 0,59* |
37,22 ± 1,37* |
41,35 ± 1,96 |
0,16 ± 0,009* |
13,94 ± 0,64* |
10,86 ± 0,44* |
2,13 ± 0,09* |
|
6. ОСА + гипотермия |
106,28 ± 0,37 |
36,52 ± 1,15 |
53,04 ± 2,07* |
0,07 ± 0,003* |
15,32 ± 0,70* |
18,25 ± 0,74* |
4,06 ± 0,18* |
|
7. Церебрамин + л/о + гипотермия |
120,53 ± 0,49* |
30,06 ± 1,32 |
42,77 ± 2,16 |
0,14 ± 0,006 |
13,09 ± 0,54* |
12,09 ± 0,50 |
2,54 ± 0,13 |
|
8. Церебрамин + ОСА + гипотермия |
109,67 ± 0,51 |
33,85 ± 1,04 |
49,48 ± 2,35 |
0,11 ± 0,004 |
14,70 ± 0,69* |
16,77 ± 0,77 |
3,48 ± 0,14 |
Примечание. * достоверные (р < 0,05) отличия показателей относительно контрольных значений.
При моделировании гипотермии (5 группа) также наблюдали повышение содержания липоперекисей и ТБК-реактивных продуктов в структурах мозга животных. Однако антиоксидантный статус в коре больших полушарий и стволовых структурах различался. В том числе в коре больших полушарий установлено снижение уровня ВГ и активности ГР, тогда как в стволовых структурах на фоне снижения активности ГР и каталазы выявлено увеличение активности ГТ и содержания ВГ по сравнению с контрольной группой. В результате накопление вторичных продуктов СРП в коре больших полушарий было выше, чем в стволовых структурах.
У животных в модели окклюзии сонных артерий и последующей гипотермии (6 группа) повышение содержания липоперекисей в структурах мозга было менее выражено относительно крыс, которым моделировали ОСА или гипотермию: в 6 группе крыс значительное накопление первичных продуктов СРП наблюдали только в коре больших полушарий относительно контроля. Одновременно наблюдали повышение активности ГПО и ГТ на фоне снижения содержания ВГ в мозге. Однако такие изменения происходили при разнонаправленных изменениях активности ГР в структурах мозга: если в коре больших полушарий происходило снижение данного показателя, то в стволовых структурах – его повышение относительно контрольной группы. Также в стволовых структурах показано возрастание каталазной активности по сравнению с 1-й группой крыс. Таким образом, в данной модели эксперимента установлены особенности ответа антиоксидантного звена свободнорадикальных процессов в разных структурах мозга: предотвращение чрезмерной активации СРП в коре больших полушарий происходит на фоне увеличения антиоксидантной емкости ГПО и ГТ, тогда как в стволовых структурах – преимущественно за счет активации ГТ и каталазы. Известно, что сродство ГПО к пероксиду водорода выше, чем у каталазы, поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях субстрата, в то же время при высоких концентрациях ключевая роль принадлежит каталазе [7]. Действительно, согласно полученным результатам исследования, именно в коре больших полушарий происходило накопление гидроперекисей.
При введении церебрамина (3 группа) увеличение содержания ТБК-реактивных продуктов происходило только в коре больших полушарий крыс относительно контроля. Одновременно показано увеличение в структурах мозга также уровня ВГ, активности ГТ и каталазы; в коре больших полушарий также обнаружено возрастание активности ГПО. Повышение про- и антиоксидантных звеньев свободнорадикальных процессов при введении пептидных препаратов связывают с так называемым их прекондиционирующим эффектом [5].
В условиях введения церебрамина перед моделированием ОСА (4 группа) в мозге выявлено накопление липоперекисей и ТБК-реактивных продуктов, активности ГПО и ГТ относительно контроля. Также в коре больших полушарий была снижена активность ГР и повышена каталазная активность, в то же время в стволовых структурах активность ГР была выше контрольного уровня. Следовательно, введение церебрамина перед ОСА снижает интенсивность СРП в мозге животных, однако механизмы, лежащие в основе данного явления, различаются в коре больших полушарий и стволовых структурах: в коре больших полушарий большую роль в снижении накопления продуктов СРП берут на себя ферменты, обладающие каталазной активностью, тогда как в стволовых структурах – глутатионтрансфераза.
При введении церебрамина перед гипотермией (7 группа) изменения показателей СРП установлены только в стволовых структурах: происходило повышение уровня липоперекисей и активности глутатионтрансферазы по сравнению с контролем. В модели введения ноотропа перед ОСА и моделированием гипотермии (8 группа) также выявлены минимальные отклонения от контрольного уровня в состоянии СРП. Так, в коре больших полушарий показано накопление липоперекисей на фоне снижения активности ГР, а также активности ГПО (0,1 < р < 0,05); в стволовых структурах наблюдали лишь повышение активности ГТ.
Таким образом, сочетанное влияние церебрамина и гипотермии оказывает более существенное протективное действие на метаболические процессы в структурах мозга крыс при окклюзии сонных артерий, нежели их раздельное применение в качестве факторов, снижающих эффекты ишемии мозга. Также установлены региональные различия защитных механизмов против развития окислительного повреждения ткани мозга.
Рецензенты:
Кличханов Н.К., д.б.н, профессор кафедры биохимии и биофизики, Минобрнауки России, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дагестанский государственный университет», г. Махачкала;
Габибов М.М., д.б.н., профессор, зав. кафедрой физиологии, анатомии и гистологии, Минобрнауки России, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дагестанский государственный университет», г. Махачкала.
Работа поступила в редакцию 16.08.2013.