По данным ВОЗ, ожоги, включая ожоги паром, в структуре травматизма занимают 3–4 % у взрослых и являются наиболее распространенными травмами у детей [18]. Актуальность проблемы ожогового травматизма определяется как медицинскими, так и социально-экономическими аспектами, которые обусловлены частотой ожогов и их последствиями: временной и стойкой утратой трудоспособности с переходом на инвалидность, а также высоким уровнем смертности от тяжёлых ожоговых травм [22]. Кроме этого, сильные ожоги оставляют, часто с последствиями на всю жизнь, рубцы, не только нарушающие внешний вид, но и функции [10].
Об актуальности и сложности изучения ожоговой болезни также свидетельствует тот факт, что даже на современном этапе единой международной классификации ожогов не существует. Важнейшим прогностическим показателем ожогов служит глубина поражения тканей. В разное время были предложены различные классификации ожогов в зависимости от глубины повреждения: Буайе (1814 г.) разработал трехступенчатую классификацию; Крейбих (1927 г.) предложил выделять пять степеней ожогов. Согласно аналитическим данным ВОЗ, в мире ежегодно получают травмы около 50 млн человек; более 100 млн подвергаются хирургическим вмешательствам [16]. По данным T. Alster (2003), келоидные и гипертрофические рубцы наблюдаются у 1,5–4,5 % общей популяции, а по результатам W. Chernoff (2007) – у 10 %. Более 4 миллионов человек страдают от рубцовых деформаций после глубоких и распространенных ожогов. Образование рубцов – нормальная функция поврежденных тканей, без которой не может существовать ни один живой организм. Рубцовая ткань не является идентичной той ткани, которую заменяет, и обладает более низкими функциональными свойствами. Необходимость предотвращения избыточного рубцеобразования после хирургических вмешательств, травм и т.д. является актуальной научно-практической задачей. Несмотря на постоянное совершенствование методов лечения термотравм и тактики послеоперационного ведения больных, образование грубых деформирующих рубцов составляет одну из серьезных проблем современной медицины [13]. Рубцы сохраняются пожизненно. Возникающие косметические и функциональные дефекты доставляют психологический дискомфорт пациенту, нарушая социальную адаптацию человека после травм и операций, и значительно влияют на качество жизни.
Несмотря на широкое обсуждение на страницах отечественной и зарубежной печати вопросов патогенеза, диагностики и лечения патологического рубцевания после операций и травм, мнения специалистов и ученых остаются крайне противоречивыми в определении единых подходов к профилактике и лечению рубцующейся ткани [3]. Диагностика патологических рубцов не представляет больших трудностей и базируется на анамнестических данных и клинических проявлениях. Lucas T, Waisman A, Ranjan R, et al., (2012) считают, что большинство описанных методов лечения и профилактики избыточного роста соединительной ткани у пациентов, у которых сформировались келоидные и гипертрофические рубцы, не основаны на глубоких представлениях о патогенетических аспектах репаративной регенерации кожи человека [10].
Между тем до настоящего времени нет таких методов лечения, которые надежно остановили бы прогрессирование патологического рубца и его рецидив после хирургического лечения. Причиной этого является недостаточная изученность процесса репаративной регенерации кожи как после ожога, так и оперативных вмешательств на коже, что диктует более глубокое изучение механизмов заживления ран кожи. До сих пор неясна роль иммунокомпетентных клеток в процессах регенерации в ожоговой ране, что не позволяет разрабатывать патогенетически обоснованное иммуномоделирование репаративных процессов при ожогах [5].
Одними из наиболее важных иммунных клеток, участвующих в воспалении и заживлении ран, являются макрофаги, которые определяют различные иммунологические процессы в коже, в том числе фагоцитоз и антигенпрезентацию. Кроме того, макрофаги производят многие цитокины и хемокины, которые стимулируют рост новых капилляров, синтез коллагена [1]. Эти представители иммунокомпетентных клеток считаются главными регуляторами воспаления и ангиогенеза, реэпителизации, заживления, а также реконструкции [12].Установлено, что лимфоциты эпидермиса выполняют функцию регуляторов пролиферативной активности кератиноцитов. Усиление активности Т-лимфоцитов в коже является одним из факторов, стимулирующих вторичную пролиферативную активность эпидермальных кератиноцитов через общие клеточные механизмы, включающие цитокины – интерлейкины (ИЛ) 1, 2, 6, 8, ФНО и др., а также факторы роста.
Главный вопрос, таким образом, касается функции различных макрофагальных типов в гомеостазе, инфекционном процессе и сценарии восстановления обожжённой кожи. Кроме того, экстраполяция результатов, полученных на примере ожогов в эксперименте на крысах, считается невозможной, как и корреляции между мышиными и человеческими макрофагами, а данные об их подтипах отсутствуют и являются серьезным препятствием для понимания иммунитета кожи человека [8, 14, 17].
Для патогенетически обоснованной активации эффекторного иммунофагоцитарного звена, правильной корреляция регенераторных процессов в зоне ожоговой раны и профилактики формирования грубых рубцов, необходимо изучение тонких механизмов регуляции и индукции иммуно моделированной репаративной регенерации в коже человека.
Целью исследования является повышение эффективности лечения больных с тяжёлыми ожогами на основе данных иммунологического мониторинга ожоговой раны в процессе заживления.
Соответственно цели были поставлены следующие задачи:
1. Получить клиническую оценку процесса заживления ожоговых ран.
2. Изучить диффероны иммуноцитов в динамике репаративных процессов в ожоговой ране: антигенпрезентирующие CD68, моноциты-макрофаги CD163 и Т4–T8 лимфоциты.
3. Установить роль иммуноцитов в репаративной регенерации кожи после термотравмы.
Материалы и методы исследований
В работе проанализирован материал кожи 145 пациентов мужского пола, получивших глубокие термические ожоги, различных возрастных групп и без соматической патологии в возрасте от 12 до 67 лет в период с 2002 по 2013 год. Группу контроля составили 28 пациентов (включая детей) в возрасте от 7 до 57 лет. Биопсийный материал фиксировался по прописи для подготовки к иммуногистохимическим исследованиям сразу после забора. Группа физиологического контроля включала цельные биоптаты кожи, полученные путем иссечения кожи боковой части живота при операциях у лиц без видимого поражения кожного покрова. Репаративные процессы в зоне термотравмы изучены от момента поступления пациента в клинику и до завершения лечения (рис. 1, а). Мониторинг проводился в одно и то же время утром в 10.00, чтобы избежать влияния суточных циркадных ритмов и только у лиц мужского пола, чтобы исключить влияние эстрогенов на пролиферативные процессы в коже пациентов. Использованы классические гистологические методы исследования с окрашиванием г/э; Victoria blu, а также иммуногистохимические методы на выявление CD4, CD8, CD 68, CD163, CD 204, TUNEL-метод на выявление апоптозирующих клеток, Ki67 для выявления пролиферативной активности, Iron hematoxilin. Анализ материала проведён с помощью микроскопа Olympus – Bx82 и цифровой камеры CDх82 с фирменным программным обеспечением.
Результаты исследований и их обсуждение
Установлено, что в процессе регенерации в ожоговой ране пролиферативная активность гена Ki67 в структурах эпидермиса и дермы нарастает до 7–10 дня после получения термотравмы, сохраняется на достигнутом уровне до 14 дня, а затем достоверно снижается до значений, соответствующих регенераторному потенциалу в первые часы при поступлении (рис. 1, б–д).
Нами отмечено, что в процессе заживления ожоговой раны на этапе гнойно-некротической фазы наблюдалась высокая степень бактериальной загрязнённости, отёчность тканей, гиперемия области раны. Иммунологический мониторинг показал, что преобладающей формой эффекторных иммуноцитов в ожоговой ране был нейтрофильный клеточный пул (рис. 2, а), что обеспечивает активное противостояние бактериальной флоры и иммунной системы. Это связано с тем, что в первой фазе заживления ожоговой раны идёт адаптация к новым физиологическим условиям функционирования поверхности повреждённой кожи, необходимости подавления первичной агрессивной микрофлоры и предотвращения дальнейшего инфицирования раны. В следующую фазу – фазу грануляции, когда должна быть обеспечена очистка раны от гнойно-некротических масс, уменьшение и исчезновение отёков, подавление бактериальной агрессии, в инфильтрате на раневой поверхности и в глубине дермы преобладают антигенпредставляющие клетки, которые обеспечивают адекватный иммунный ответ на повреждение (рис. 2, б–г). Одновременно в соответствующей динамике идентифицируются лимфоциты с рецепторами CD4 (рис. 3). Известно, что рецепторы СD4 экспрессируются преимущественно на Т-лимфоцитах и, будучи комплементарными HLA-антигенам II класса, обеспечивают контакт Т-клеток с макрофагально-гистиоцитарным микроокружением, на клетках которого экспрессируются HLA II класса [6]. Взаимодействие CD4 с HLA II класса в ходе межклеточных контактов способствует ассоциации CD4 и Т-клеточного рецептора в единый комплекс и последующей активации пролиферативного и секреторного ответа Т-клеток [7, 11].
В целом нами отмечено, что в процессе заживления ожоговой раны наблюдается периваскулярное разрежение Т-клеток по сравнению с нормальной здоровой кожей. Существует заметная активация и проникновение в зону раневой поверхности клеток памяти T CD4+ в первый период воспаления после ожога. Также увеличивается количество антиген представляющих клеток (например, клетки Лангерганса (LCs), воспалительные дендритные клетки эпидермиса (IDEC) и макрофаги. Наблюдается дегрануляция тучных клеток. Регенераторный процесс в коже после ожога сопровождается её поражением и ремоделированием, вызванным хроническим воспалением. Эти изменения кожи связаны с утолщением и увеличением осаждения коллагена в дерме.
б 
г 
д 
Рис. 1. а – ожоговый больной 14 лет (обширные ожоги 3б степени); б–д – Ki67 в эпидермисе (б, в, г) и дерме (д) кожи человека в зоне ожоговой раны; б – 7-е сутки после термотравмы; в – 10-е сутки после термотравмы; г – 12 сутки; б–д – иммунная гистохимия. Микрофото. Ув.: б – х400; в–д – х800
В фазу эпителизации происходит восстановление кожного покрова с формированием рубца, окончательное заживление раны. Поэтому в зоне ожоговой раны и подлежащей верхним слоям соединительной ткани появляются клетки, отвечающие за реструктуризацию кожного покрова. Мониторинг показал, что на этом этапе идентифицируются CD8 и CD163 макрофаги, фибробласты, тучные клетки (рис. 5). Поскльку в третьей фазе следует обеспечить максимальную защиту раны от внешних воздействий, чтобы способствовать полноценной регенерации, появляются CD8+-лимфоциты, которые продуцируют те же цитокины, что и CD4+-Тх1 (ФНО-альфа и бета, ИЛ-2,3, гамма-ИФ, ГМ-КСФ). Эти иммуноциты ограничивают иммунный ответ, предотвращая реакции гиперчувствительности ИС и запуск аутоиммунных процессов.
Полученные нами данные являются результатом того, что в стадию ожоговой токсемии в результате активации парасимпатической системы происходит расширение концевых артериол и начинается перфузия крови по капиллярному руслу и миграция эффекторных клеток иммунофагоцитарного звена в повреждённую ткань. Но одновременно с этим начинается массивный выход в кровеносное русло продуктов распада некротических тканей из зоны термического поражения. Это вызывает явления эндотоксикоза, что негативно влияет как на саму сосудистую стенку капилляров и артериол, так и на ее проницаемость. В результате этого количество функционирующих капилляров хоть и выше, чем в стадию ожогового шока, но тем не менее значительно ниже нормальных значений.
б 
г 
Рис. 2. CD 68 в дерме кожи человека в зоне ожоговой раны: а – 1-е сутки после термотравмы; б – 2-е сутки после термотравмы; в – 7 сутки; г – 10 сутки; а – гематоксилин-эозин; б–г – иммунная гистохимия. Микрофото. Ув. х800
а 
б 
Рис. 3. CD4 в дерме кожи человека в зоне ожоговой раны: а – 4-е сутки после термотравмы; б – 7-е сутки после термотравмы. Иммунная гистохимия. Микрофото. Ув. х800
а 
б 
Рис. 4. CD8 в дерме кожи человека в зоне ожоговой раны: а – 4-е сутки после термотравмы; б – 7-е сутки после термотравмы. Иммунная гистохимия. Микрофото. Ув. х800
а 
б 
Рис. 5. CD204 в дерме кожи человека в зоне ожоговой раны: а – 4-е сутки после термотравмы; б – 7-е сутки после термотравмы. Иммунная гистохимия. Микрофото. Ув. х800
Рис. 6. Диаграмма. Характеристика иммунного гомеостаза кожи в динамике заживления ожоговой раны
Заключение
Данные, полученные в поздние стадии ожоговой болезни, свидетельствуют, что пациенты, перенесшие тяжелую термическую травму, не могут считаться выздоровевшими даже после выписки из стационара, что согласуется с данными других авторов [19, 20]. Продолжается угнетение T-клеточного звена, клеток Лангерганса, а также снижена кооперация между T- и B-лимфоцитами в коже больных после ожоговой травмы [21]. Причина этого – серьезные нарушения иммунной системы в острый период травмы, которые приводят к значительным морфофункциональным изменениям в тканях и органах пострадавших. Интегральные изменения в МЦР как показатели состояния организма в целом также отличаются от показателей организма практически здоровых людей. Клетки Лангерганса играют ключевую роль в афферентном звене иммунного ответа и осуществляют макрофагально-Т-клеточное взаимодействие, в частности, представление растворимых белков и гаптенов сенсибилизированным Т-лимфоцитам, стимулирование аллогенных Т-лимфоцитов в смешанной эпидермально-лимфоцитарной системе, индуцирование цитотоксических лимфоцитов, кооперацию Т- и В-лимфоцитов, а также участие в регулировании роста и дифференцировке эпидермальных клеток [2, 9]. Присутствие клеток Лангерганса способствует отторжению аллогенного трансплантата [4]. Однако сложный механизм сохранения гомеостатических процессов в ткани не только зависит от пролиферации и дифференцировки клеток, но и ассоциирован с характером их запрограммированной гибели – апоптозом [15]. Пути реализации программы апоптоза разнообразны, зависят как от индивидуальных особенностей клеток, так и от характера и степени выраженности внешних и внутренних воздействий, вызывающих ее включение [16]. Имеются единичные сообщения, позволяющие предполагать, что в формировании келоидных рубцов и развитии склеродермических изменений кожи задействованы механизмы апоптоза. Апоптоз и некроз приводят к селективной убыли определенных клеточных популяций дермы (прежде всего эндотелия), участвуя в формировании аваскулярного коллагена, характерного для рубцевания и келоида.
Выводы
Тяжелообожжённым показана ранняя некрэктомия до значительного ослабления защитных сил организма.
Высокая пролиферативная активность структур дермы в зоне термотравмы и эпидермиса неповреждённой кожи отмечается от 7 до 10 дня после получения термотравмы.
Наиболее высокая пролиферативная активность клеточных элементов наблюдается в области краевой эпителизации раны.
Повышение АПК в ожоговой ране нарастает до 14 дней после термотравмы и снижается с 14 дня.
В аутодермотрансплантатах, пересаженных в сроки до 7-х суток после термической травмы, можно прогнозировать превалирование регенераторных процессов над деструктивными. В аутодермотрансплантатах, пересаженных в сроки после 7-х суток, можно прогнозировать превалирование деструктивных процессов. Высокая пролиферативная активность во всех структурах кожи в зоне термотравмы, в интактной коже и на границе повреждённой и интактной кожи отмечается в сроки до 7 дней после ожоговой травмы.
Иммунологический мониторинг свидетельствует, что при ранней хирургической тактике экономический эффект будет выше вследствие значительного сокращения сроков лечения больных в стационаре, снижения прямых и непрямых расходов на лечение на 10 %.
Рецензенты:
Храмова И.А., д.м.н., профессор, врач акушер-гинеколог, Приморский краевой диагностический центр, г. Владивосток;
Шульгина Л.В., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией микробиологии, ФГУП «ТИНРО-Центр», г. Владивосток.
Работа поступила в редакцию 15.08.2013.