Как известно из литературных источников, презентация антигена антигенпредставляющими клетками является ключевым этапом в формировании адекватного иммунного ответа. В результате контакта между антигенпредставляющей клеткой и Т-лимфоцитом образуется «иммунологический синапс», одна из функций которого заключается в активации клеток-эффекторов и запуске секреции цитокинов, поляризующих иммунный ответ. Так, известно, что наиболее часто в роли антигенпредставляющих клеток выступают дендритные клетки (DC) [12, 13, 17]. В литературных источниках [11, 13] подробно описаны морфофункциональные особенности DC, но в контексте туберкулезной патологии имеются единичные и разрозненные данные, которые не описывают полной картины их участия в иммунопатогенезе туберкулеза легких.
DC несут на своей поверхности широкий спектр мембранных рецепторов, в частности, относящиеся к семейству TLRs (toll-likereceptors). Данное семейство рецепторов включает 13 представителей, способных связывать высокомолекулярные паттерны в структуре различных микроорганизмов: липополисахариды (ЛПС), белки, гликопротеины и др. При взаимодействии TLR со своим лигандом запускается процесс димеризации рецептора, в результате чего сигнал передается на внутриклеточные адаптерные белки: MyD88 (myeloiddifferentiationfactor 88), TIRAP (TIRdomain-containingadaptorprotein), TRIF (TIR-domain-containingadaptor-includingIFNfi) и TRAM ((TRIF)-relatedadaptormolecule). Активация адаптерных белков в конечном итоге приводит к активации транскрипционного фактора NF-kB, который, транслоцируясь в ядро, индуцирует экспрессию генов провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, фактора некроза опухолей α (TNFα), хемокины), костимуляторных молекул (CD80, CD86, CD83), молекул гистосовместимости (HLA класса II) [1, 2, 3, 7, 19].
Касательно туберкулезной инфекции, распознавание липоарабиноманнана клеточной стенки микобактерий туберкулеза DC осуществляется с помощью TLR типа 2 (TLR2), в результате чего инициируется процесс внутриклеточной трансдукции сигнала и запускается противотуберкулезный иммунный ответ [4, 18]. Связывание микобактериального паттерна сопряжено с процессом созревания DC, в результате чего теряется их способность к эндо- и пиноцитозу, но при этом увеличивается экспрессия на поверхности CD80, CD86, HLA класса II. Перечисленные молекулы необходимы для формирования иммунологического синапса с Т-лимфоцитом и активации последнего, в том числе посредством секреции DC провоспалительных цитокинов – IL-12 и IL-18 [13].
Наиболее важной функцией IL-12 является поляризация дифференцировки наивных Т-хелперов (Th0) в направлении Т-хелперов типа 1 (Th1) с последующей секрецией ими интерферона γ (IFNγ). Таким образом, происходит отрицательная селекция Th2-лимфоцитов и формирование иммунного ответа по Th1-типу. Однако для продукции IFNγ Т-клетками необходимо синергичное влияние двух цитокинов: IL-12 и IL-18. Механизм синергичности опосредован реципрокной стимуляцией экспрессии рецепторов к IL-12 и IL-18, то есть каждый из цитокинов стимулирует экспрессию рецептора другого цитокина на поверхности клетки. Более того, рецептор к IL-18 представлен только на Th1-лимфоцитах, что определяет его основным ростовым и дифференцировочным фактором для данного типа клеток [8, 14].
В ходе изучения иммунопатогенеза туберкулезной инфекции ранее нами было показано, что в его основе лежат анергия Т-лимфоцитов и поляризация иммунного ответа в направлении Th2-реакций [6]. Было сформулировано предположение, что данные нарушения происходят по причине недостаточной активации Т-лимфоцитов в процессе из взаимодействия с антигенпредставляющими клетками, в частности, DC [10, 12].
В этой связи, целью настоящего исследования явилось изучить у больных туберкулезом легких иммунофенотипические и функциональные свойства дендритных клеток, характеризующие их способности к индукции иммунного ответа.
Материалы и методы исследования
В группу обследуемых лиц было включено 100 больных с впервые выявленным туберкулезом легких в возрасте от 39 до 60 лет (средний возраст пациентов – 42 ± 10 лет ). Клинический осмотр, сбор анамнеза, физикальные методы обследования и постановка диагноза осуществлялись в Томской областной туберкулезной клинической больнице. Группу здоровых доноров составили 50 человек, сопоставимых с группой больных туберкулезом легких по половозрастным характеристикам.
Для последующей трансформации в DC мононуклеарные лейкоциты выделяли из гепаринизированной венозной крови, забранной из локтевой вены в объеме 20 мл утром натощак, путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина; между собой фракции моноцитов и лимфоцитов разделяли путем центрифугирования в двойном градиенте плотности перколла. Моноцитарную клеточную взвесь отмывали средой RPMI-1640 и вносили в плоскодонные 24-луночные планшеты в количестве 1∙106 клеток в 1 мл. Культивирование осуществляли в полной питательной среде, содержащей 10 % эмбриональную телячью сыворотку, 50 мкг/мл пенициллина-стрептомицина, 0,29 мкг/мл L-глутамина с добавлением цитокинов (IL-4 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора роста (GM-CSF)) («Sigma», США), при 370С в СО2-инкубаторе в течение 7 дней. Замена полной питательной среды производилась на 3-и и 5-е сутки. На 5-е сутки культуральную клеточную суспензию дополнительно стимулировали липополисахаридом в концентрации 5 мг/мл («Sigma», USA). Микроскопическое исследование DC осуществлялось на микроскопе фирмы CarlZeiss (Германия). С помощью микроскопа CarlZeiss оценивались морфологические изменения моноцитов при трансформации их в DC (в частности, наблюдалось снижение адгезионных свойств моноцитов и последующее формирование групп клеток в питательной среде; формирование отростков DC) [15]. Иммунофенотипирование трансформированных зрелых DC проводили методом проточной цитометрии на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител CD86, CD80 TLR2, меченных соответственно флуресцентными красителями (FITC, PE, PE), и изотипических контролей («R&DSystems», США). Анализ полученных данных осуществляли при помощи программного приложения BD Cell Cell Quest for Mac OS® X.
Концентрацию цитокинов (IL-12, IL-18) определяли в супернатантах DC на 7-е сутки культивирования путем иммуноферментного анализа (eBioscience, США).
Обработку полученных результатов проводили на основе общепринятых статистических методов с помощью программы Statistic for Windows Version 10. Для оценки нормальности распределения использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Поскольку исследованные количественные признаки в группах сравнения не подчинялись нормальному распределению для попарного сравнения выборочных показателей применяли критерии U Манна‒Уитни (для независимых выборок) и Вилкоксона (для зависимых выборок). Для всех количественных признаков в сравниваемых группах вычисляли медиану, 25 и 75 %-й квартили. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принимали равным 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенного исследования установлено, что количество DC, экспрессирующих TLR2, у больных туберкулезом легких оказалось в 2,5 раза ниже, чем в группе здоровых доноров (таблица). Как указывалось выше, данный рецептор отвечает за связывание с липоарабиноманнаном микобактерий туберкулеза и запускает последующую сигнальную трансдукцию, необходимую для полноценного созревания DC и формирования антимикобактериального иммунного ответа. [3, 9]. Следовательно, можно предположить, что в результате дефицита TLR типа 2 на DC нарушается взаимодействие клеток с возбудителем и цепь последующих за этим процессов.
Данное предположение подтверждается тем, что дефицит TLR2+DC у больных туберкулезом легких сочетался со снижением количества клеток, несущих на поверхности плазматической мембраны молекулу костимуляции CD86. Так, в группе больных туберкулезом легких относительное содержание CD86+ клеток было в 1,8 раза ниже нормы (таблица). Известно, что отсутствие активационного сигнала от костимуляторной молекулы CD86 DC опосредует нарушение активации и анергию Т-лимфоцитов. [5, 13].
Иммунофенотипические и функциональные особенности миелоидных дендритных клеток, трансформированных из моноцитов периферической крови invitro, у здоровых доноров и больных туберкулёзом лёгких, Ме (Q1-Q3)
|
Параметры |
Группа исследования |
|
|
Здоровые доноры (n = 50) |
Больные туберкулезом легких (n = 100) |
|
|
Количество TLR2+ дендритных клеток, % |
3,70 (2,95–4,50) |
1,50 (0,50–2,10) р1 < 0,05 |
|
Количество CD86+ дендритных клеток, % |
60,35 (48,05–71,25) |
33,20 (23,40–43,10) р1 < 0,05 |
|
Количество CD80+ дендритных клеток, % |
1,30 (0,82–1,91) |
3,60 (3,00–5,60) р1 < 0,001 |
|
Уровень секреции IL-12, пг/мл |
16,69 (14,67–20,87) |
26,87 (22,52–39,78) р1 < 0,05 |
|
Уровень секреции IL-18, пг/мл |
31,03 (23,25–34,04) |
33,02 (18,62–55,14) |
Примечание: р – уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями у здоровых доноров.
Что касается другой молекулы костимуляции – CD80, то у больных туберкулезом легких количество несущих ее DC было, напротив, в 2,8 раза выше по сравнению с таковым у здоровых доноров (таблица). Однако показано, что связывание CD80 DC с рецептором на клетке-эффекторе является более значимым в процессе отторжения аллотрансплантата и противоопухолевой, нежели противоинфекционной защиты [9].
Одной из важных характеристик степени зрелости DC и их активационного статуса является секреция клетками IL-12 и IL-18. В ходе эксперимента было показано, что секреция IL-12 DC у больных ТЛ была повышенной в 1,6 раза относительно значений в группе здоровых доноров. При этом уровень продукции IL-18 DC не претерпевал выраженных отклонений от нормы (таблица). Возможно, повышение секреции провоспалительного IL-12 DC носит компенсаторно-приспособительный характер в связи с недостаточной активацией Т-лимфоцитов со стороны молекул костимуляции DC или характерным для туберкулеза дефицитом на Т-клетках взаимодействующих с ними рецепторами (CD28) [7]. Схожие данные были получены M.L. Ollerosetal. [2007], показавшими в эксперименте на трансгенных мышах, инфицированных возбудителем туберкулеза, повышение секреции IL-12, которое, однако, по заключению авторов, не влияло на образование гранулемы, дифференцировку Т-лимфоцитов в Th1-клетки, секрецию INFγ и элиминацию патогена.
Заключение
Полученные результаты позволяют полагать, что штаммы микобактерий туберкулеза способны ингибировать первый этап противотуберкулезного иммунного ответа, заключающийся в их связывании DC и представлении микобактериального антигена клеткам-эффекторам. Ведущими патогенетическими факторами нарушений индуктивной фазы иммунного ответа при туберкулезе легких являются дефицит на DC рецепторов типа TLR2 и молекул костимуляции CD86. Очевидно, что нарушение созревания и дисфункция DC являются результатом как прямого действия инфицирующего агента на процесс генерации DC из моноцитов периферической крови DC, так и следствием нарушений механизма трансдукции сигнала рецептор- и цитокинзависимой активации клеток [7; 20].
Работа выполнена при финансовой поддержке Совета по грантам при Президенте РФ для ведущих научных школ (16.120.11.614-НШ) и на средства персонального гранта от компании ОПТЭК по поддержке молодых ученых 2012 г. (договор от № 8/11 КЦ от 10 апреля 2012 г.).
Рецензенты:
Кологривова Е.Н., д.м.н., профессор кафедры иммунологии и аллергологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г.Томск;
Зима А.П., д.м.н., профессор кафедры молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России г. Томск.
Работа поступила в редакцию 01.08.2013.