Актуальность исследований регенеративных процессов печени с каждым годом не теряет своего значения. Связано это, прежде всего, с высокими цифрами травматизации органа и послеоперационной летальностью.
Частота повреждения печени колеблется от 8,2 до 56 % от всех травм брюшной полости [4, 5], а послеоперационная летальность при обширных резекциях печени в среднем составляет от 9 до 33 %, а при правосторонних гемигепатэктомиях может достичь 50 % [2].
Летальность при закрытых повреждениях живота может достигать до 56–78 % [3].
Трудность диагностики обусловлена тяжестью состояния пострадавших, совокупностью сочетанных повреждений, шоком и большой кровопотерей [1].
После травматизации печени происходит её компенсаторная регенерация с образованием новых клеточных элементов путем митотического деления оставшихся. Это весьма энергозатратный процесс, поэтому происходит резкий скачок белка в гепатоцитах печени.
Именно исследование общего белка позволяет более правильно оценить функциональное состояние органа в целом, и, как следствие, правильно построить в дальнейшем лечебно-восстановительный процесс.
Цель исследования ‒ определить циркадианные колебания общего белка в гепатоцитах печени крыс на 3-и сутки после механической травмы органа.
Метод и материалы исследования
Объектом исследования послужили 48 беспородных крыс средним весом 180 грамм, в возрасте 90 суток. Все животные содержались в стандартных условиях вивария, отдельно друг от друга, с правильно сбалансированным питанием. Каждое животное выводили из эксперимента в первые минуты каждого часа.
Животные были разделены на 2 группы:
1) контрольная группа – исследование циркадианных колебаний общего белка в гепатоцитах печени (24 крысы – самцы);
2) экспериментальная группа – исследование циркадианных колебаний общего белка в гепатоцитах печени после механической травмы (24 крысы – самцы).
Животное помещали в специализированную камеру, вводили в медикаментозный сон, после чего приступали к эксперименту.
В качестве анестезирующего вещества использовали раствор хлороформа в дозе 1 мл/180 гр.
Протокол эксперимента был составлен в соответствии с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP); с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003, «Об утверждении правил лабораторной практики» (Минздрав ССР № 755 от 12.08.1977).
У каждого выведенного из эксперимента лабораторного животного брали исследуемый орган для изготовления гистологических микропрепаратов. Микропрепараты изготавливали с помощью микротома МЗ-2. После получения гистологических срезов проводилась их окраска. Использовались методы окраски гематоксилином и эозином и окраска прочным зеленым при pH 2,2.
Животным экспериментальной группы проводилась механическая травматизация органа типичный (анатомический) методом резекции: срединная лапаротомия. После обработки зоны резекции послойно разрезали кожу, брюшину, и, обнажив орган, проводили механическую травму.
Повреждение органа осуществлялась скальпелем. Разрез проводили в V сегменте печени длиной 10 мм, глубиной 4 мм.
Далее на печень накладывали узловые швы и послойно зашивали ткани.
Выведение животных из эксперимента осуществлялось на 3 сутки после механической травматизации аналогичным путем, что и контрольная группа.
Количественное определение белка в контрольной и экспериментальной группе проводилось с помощью комплекса «Морфолог». Определение концентрации белка проводилось в 300 гепатоцитах в цитоплазме клетки.
Материалы обрабатывались на персональном компьютере с помощью программ «Microsoft Office Windows 2007», «Microsoft Office Excel 2007».
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе исследования выявлены следующие колебания общего белка (таблица).
Анализируя табл. 1, можно увидеть четкую обратно пропорциональную зависимость между группами. Min значение общего белка в контрольной группе приходится на 12 часов и составляет 4220 ± 10 усл. ед. В экспериментальной группе в это время наблюдается пик активности max значение 7389 ± 19 усл. ед. В 23 часа в контрольной группе наблюдается max значение, оно составляет 4831 ± 12 усл. ед., в экспериментальной группе наблюдается min в 24 часа – 6264 ± 11 усл. ед.
Вероятнее всего, так как крысы являются по свой природе ночными животными, поэтому пик активности общего белка приходится именно в эти часы. Регенеративные процессы в эти часы будут протекать более быстро, чем у животных, получивших механическую травму печени в дневные часы.
Можно предположить, что у людей процесс более благоприятного послеоперационого течения будет наблюдаться у пациентов, у которых операция проводилась в дневные часы.
Колебания общего белка в гепатоцитах печени самцов крыс в зависимости от времени суток (в усл. ед.)
|
Время суток, часы |
Количество белка, усл. ед. |
|
|
Контрольная группа |
Экспериментальная группа |
|
|
00.00 |
4801 ± 16 |
6264 ± 11 |
|
01.00 |
4757 ± 13 |
6319 ± 07 |
|
02.00 |
4698 ± 24 |
6412 ± 07 |
|
03.00 |
4649 ± 07 |
6499 ± 13 |
|
04.00 |
4602 ± 10 |
6557 ± 15 |
|
05.00 |
4579 ± 11 |
6647 ± 11 |
|
06.00 |
4546 ± 10 |
6701 ± 07 |
|
07.00 |
4493 ± 15 |
6777 ± 24 |
|
08.00 |
4451 ± 13 |
6825 ± 13 |
|
09.00 |
4404 ± 08 |
6978 ± 19 |
|
10.00 |
4364 ± 11 |
7034 ± 15 |
|
11.00 |
4321 ± 16 |
7294 ± 17 |
|
12.00 |
4220 ± 10 |
7389 ± 19 |
|
13.00 |
4349 ± 15 |
7263 ± 16 |
|
14.00 |
4420 ± 13 |
7088 ± 09 |
|
15.00 |
4499 ± 10 |
7001 ± 11 |
|
16.00 |
4529 ± 12 |
6924 ± 12 |
|
17.00 |
4566 ± 09 |
6853 ± 17 |
|
18.00 |
4604 ± 17 |
6750 ± 13 |
|
19.00 |
4648 ± 18 |
6661 ± 10 |
|
20.00 |
4708 ± 05 |
6584 ± 14 |
|
21.00 |
4734 ± 15 |
6493 ± 19 |
|
22.00 |
4761 ± 13 |
6412 ± 16 |
|
23.00 |
4831 ± 12 |
6303 ± 17 |
На гистограмме (рисунок) отчетливо видно снижение общего белка в цитоплазме гепатоцитов к 12 часам, у контрольной группы и рост показателей ‒ в экспериментальной.
Приблизительно равные средние значения общего белка в контрольной группе наблюдается в 4 и 18 часов и составляют 4602 ± 10 и 4604 ± 17 усл. ед. соответственно, а также в 7 и 15 часов – 4493 ± 15 и 4499 ± 10 усл. ед. соответственно. В экспериментальной группе почти равные значения наблюдаются в 3 и 21 час и составляют 6499 ± 13 и 6493 ± 19 усл. ед., соответственно. Абсолютно равное значение соответствует 2 и 22 часам и составляет 6412 усл. ед.
Изучая рисунок, видно, что в среднем за один час количество общего белка в контрольной группе изменяется на 51 усл. ед., однако между 4 и 5 часами утра зафиксировано минимальное изменение соотношения общего белка, оно составляет 23 усл. ед. Довольно высокое изменение показательней характерно перед минимальным значением в 12 часов и составляет между 11 и 12 часами 101 усл. ед. и между 12 и 13 часами – 129 усл. ед. Также можно наблюдать 2 скачка показателей между 13 и 14 часами на 79 усл. ед., и перед и после максимального значения между 22 и 23 часами и – между 23 и 0 часами – изменение на 70 усл. ед.
Изменение количества общего белка в гепатоцитах печени крыс на 3 сутки после механической травмы в сравнении с нормой
В экспериментальной группе замечено, что в среднем за один час количество общего белка изменялось на 93 усл. ед., max значение наблюдается между 10 и 11 часами и составляет 260 усл. ед., min значение соответствует промежутку времени между 23 и 24 часами и составляет 39 усл. ед.
Выводы
Таким образом, можно отметить, что уменьшение метаболической активности работы гепатоцитов в норме у крыс наблюдается к 12 часам.
После 12 часов начинается активация синтетических процессов в гепатоцитах, к 23 часам содержание общего белка становится максимальным.
Под действием стрессового фактора, механической травматизации наблюдается смещение циркадианных колебаний общего белка в гепатоцитах печени крыс.
Регенеративные процессы протекают быстрее, если травматизация органа осуществлялась в момент его гиперактивности.
Рецензенты:
Сентюрова Л.Г., д.м.н., зав. кафедрой биологии, ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия», г. Астрахань;
Ермолаев Д.О., д.м.н., профессор кафедры уголовно-правовых дисциплин, Астраханский филиал ФГБОУ ВПО «Саратовская государственная юридическая академия», г. Астрахань.
Работа поступила в редакцию 19.07.2013.