Ампутации нижних конечностей – это вызов современной медицине. В разных странах мира производится эта инвалидирующая операция. Существенную долю среди них составляют больные сахарным диабетом. Смертность при СД уже не обусловлена острыми осложнениями, такими как гипергликемия, а чаще является следствием хронических осложнений этого заболевания, среди которых наиболее частое – синдром диабетической стопы. По данным статистических исследований, каждые 10–15 лет число людей, болеющих диабетом удваивается. Приблизительно 40–60 % всех нетравматических ампутаций нижних конечностей проводится у больных диабетом. У 80 % больных сахарным диабетом спустя 15–20 лет после начала болезни ампутируются одна или обе нижние конечности. В 40 % наблюдений после первой ампутации на уровне бедра или голени больные теряют подвижность и могут передвигаться только в пределах квартиры. С увеличением возраста больных прослеживается тенденция увеличения доли больших ампутаций, так, у лиц возрастной категории 65–74 года ампутации голени и бедра составляют 32 и 18 %, среди лиц старше 75 лет ‒ 34 и 28 % соответственно. Уровень ампутации определяет летальность. Ампутация конечности – операция, травматичная как для самого больного, так и для его семьи. Высокие ампутации приводят к ограничению социальной адаптации пациентов, существенно сокращают продолжительность жизни больных в результате поражения контралатеральной конечности и присоединения различного рода осложнений. Нижняя конечность, удаляемая во время вынужденной ампутации, ‒ это важное депо костного мозга, где в полости бедренной кости находится около 25 % всего костного мозга данного пациента. Важной особенностью костного мозга является его одновременная принадлежность двум регуляторным системам организма – системе крови и иммунной системе, клетки которых участвуют в обеспечении адаптивных реакций. В настоящее время доказано, что восстановление поврежденного органа происходит не только за счет активации органных регионарных стволовых клеток, но и за счет миграции в зону повреждения мезенхимальных стволовых клеток из других органов, и, прежде всего, из костного мозга. Если при операции, например, ампутации конечности на уровни бедра, удаляется до 25 % всего костного мозга, то возможности к репарации и восстановлению снижены из-за уменьшения количества клеток, отвечающих за это. Иммунная система при ампутации конечности сокращена на четверть, и как долго сохранится созданный иммунодефицит ‒ зависит от индивидуальных особенностей пациента. Важно во время проведения вынужденной ампутации конечности снизить потери костного мозга. Применение тканевых и клеточных технологий уже вышло из разряда доклинических исследований. Ближайшая задача биомедицинских исследований в этой области – применение высоких клеточных технологий [1]. Получение стволовых клеток путем культивирования имеет несколько общеизвестных недостатков и, в первую очередь, опасность отторжения. Большинство известных технологий взятия костного мозга у живых лиц с целью последующей трансплантации ткани костного мозга или выделенного концентрата стволовых клеток предполагает использование методик инвазивной трепанобиопсии [5]. Впервые мезенхимальные стволовые клетки были обнаружены именно в костном мозге и долгое время считалось, что основным депо стволовых клеток является именно костный мозг. В последние годы во всем мире началось интенсивное изучение стволовых клеток из различных источников. Было показано, что стволовые клетки присутствуют в любой ткани и органе: в печени, селезенке, жировой ткани и пр. Вместе с тем в практике хирургических стационаров достаточно часто приходится иметь дело с необходимостью проведения ампутаций конечностей. По статистическим данным, в США ампутации нижних конечностей ежегодно проводятся примерно у 150000 человек [2]. Предполагается, что среди прочих равных обстоятельств определенное значение в этом имеет и факт утраты вместе с костно-мозговой тканью, находящейся в ампутированной кости, до 25 % всего количества стволовых клеток пациента [3]. Полученную в результате вынужденной операции костно-мозговую ткань следует рассматривать как один из возможных источников стволовых клеток, в том числе и с целью последующей аутотрансплантации. В настоящее время клеточная терапия применяется при многих заболеваниях, которые ранее считались неизлечимыми. Лечение стволовыми клетками возможно при 1 и 2 типе сахарного диабета. Для лечения сахарного диабета применяются стволовые клетки, полученные из костного мозга. Цель лечения диабета – предупреждение его осложнений, снижение уровня вводимого инсулина и нормализация уровня глюкозы крови. При получении стволовых клеток из ампутированной конечности (что часто наблюдается при сахарном диабете) можно использовать их для данного больного с целью улучшения качества его жизни и профилактики осложнений диабета.
Целью исследования является демонстрация возможности выделения стволовых клеток, полученных из костного мозга бедренной кости ампутированной конечности. Провести сравнительную оценку полученных результатов с традиционной костно-мозговой пункцией. Поставленную задачу решают за счет того, что в операционной непосредственно после ампутации извлекают костный мозг из костно-мозгового канала бедренной кости в стерильную емкость с последующей транспортировкой в лабораторию.
Выделение клеток костного мозга: костномозговую массу объемом 3 мл гомогенизировали в 4 мл PBS. Полученную суспензию пропускали через нейлоновый фильтр с порами 40 мкм. Три раза клетки отмывали PBS-центрифугированием 5 мин при 900 g. Клетки разводили PBS до конечной концентрации 600 тыс. в 1 мл. Определение CD34 + клеток: CD34 + определяли на проточном цитофлюориметре BD FACS Canto II по стандартной методике. В качестве флюоресцентной метки использовались меченые FITC антитела (BD) к CD34, отрицательный контроль – антитела, меченные FITC к мышиным IgG1 (BD). CD34 + клетки считали от числа всех клеток в суспензии [6].
Как мы видим из таблицы, содержание стволовых клеток в костном мозге, полученном из ампутированной конечности, намного выше, чем количество стволовых клеток, полученных при пункции.
Количество стволовых клеток, полученных при пункции, не превышает 0,1 % [3], а количество стволовых клеток, полученных из ампутированной конечности, больше в несколько раз (от 2 до 38 раз).
Содержание стволовых клеток в костном мозге ампутированной конечности больных
|
Больной |
Возраст |
% стволовых клеток |
Источник (костного мозга) |
|
Больной А. |
78 лет |
0,18 % |
Бедренная кость |
|
Больной В. |
65 лет |
0,2 % |
Бедренная кость |
|
Больной С. |
72 года |
3,8 % |
Бедренная кость |
Заключение
1) большой объем костного мозга (в сравнении с пункцией);
2) техническая простота взятия материала;
3) высокое содержание стволовых клеток в костном мозге ампутированной конечности (возможность клеточной терапии без культивирования);
4) больной не подвергается пункции.
Ни один из существующих на данный момент источников СК человека или методов их получения не может полностью обеспечить потребности исследователей и требования клиницистов. Получение взрослых СК ассоциировано с применением инвазивных, травмирующих, болезненных для донора (не без риска осложнений) и, что немаловажно, дорогостоящих процедур. Все это, безусловно, ограничивает экспериментальные исследования СК человека и тормозит внедрение клеточных технологий в клиническую практику [1]. Ампутированную конечность, полученную в результате вынужденной операции, можно рассматривать как один из наиболее доступных источников стволовых клеток, в том числе и мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Способность к дифференцировке в различные клеточные типы делает МСК перспективными с точки зрения возможного использования для клеточной терапии целого ряда приобретенных и наследственных заболеваний. При введении в системный кровоток МСК способны целенаправленно мигрировать в участок поражения [8].
Можно неинвазивным методом получить большое количество материала для выращивания стволовых клеток, а также быстро создать банк стволовых клеток костного мозга и подбирать в будущем гистосовместимых доноров. Применение аутотрансплантации МСК кажется наиболее перспективным на данном этапе развития клинической науки, так как оно позволяет избежать этических и иммунных проблем, связанных с трансплантацией от донора к реципиенту. Кроветворные стволовые клетки уже на протяжении трех десятилетий используются для восстановления кроветворения у пациентов с онкологическими и гематологическими заболеваниями. Активно разрабатываются подходы к применению трансплантации стволовых клеток при лечении заболеваний, которые до последнего времени считались неизлечимыми с помощью традиционных подходов [8]. Внедрение клеточных технологий в клиническую практику является актуальной задачей современной медицины.
Рецензенты:
Сухоруков А.М., д.м.н., профессор, старший научный сотрудник НИИ медицинских проблем Севера, г. Красноярск;
Никифоров С.Б., д.м.н., профессор, старший научный сотрудник института «Хирургия», г. Иркутск.
Работа поступила в редакцию 01.07.2013.