Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Николаева Л.П. 1 Черданцев Д.В. 1 Горбенко А.С. 2 Ольховский И.А. 2

---

1 ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения РФ

2 Красноярский филиал ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения РФ

В настоящее время мы стоим на пороге активного применения клеточных технологий в клинической практике. В связи с этим очень актуальным является поиск новых доступных источников стволовых клеток, одним из которых является использование ампутированной конечности как источник костного мозга, богатого стволовыми клетками. У больных с критической ишемией нижних конечностей во время вынужденной ампутации удаляется не только конечность, но и около 25 % всех стволовых клеток, что значительно снижает возможности организма к восстановлению. Содержание стволовых клеток в костном мозге бедренной кости соответствует терапевтической дозе и может использоваться для аутологической трансплантации данному больному. Мононуклеарные фракции костного мозга ампутированной конечности, полученные в стерильных условиях операционной, могут в течение 1,5–2 часов быть готовы к применению. Этот источник стволовых клеток позволит быстро создать банк клеток костного мозга.

Статья в формате PDF

270 KB

стволовые клетки

клеточная терапия

гемопоэтическая стволовая клетка

аутотрансплантация

клеточная трансплантация

1. Пальцев М.А. Медицина ХХI века в свете клеточной биологии // Вести. РАМН. – 2004. – № 9. – С. 3–11.

2. Питерс-Хармел Э., Матур Р. Сахарный диабет: диагностика и лечение. – М.: ИД «Практика», 2008.2. Руководство по лабораторной гематологии: пер. с англ. Б. Сисла; под общ. ред. А.И. Воробьева. – М.: Практическая медицина, 2011. – 352 с.

3. Руководство по лабораторной гематологии: пер. с англ.Б. Сисла; под общ. ред. А.И. Воробьева. – М.: Практическаямедицина, 2011. – 352 с.

4. Bruder S.P., Fink D.J., Caplan A.I. Mesenchymal stem cells in bone development, bone repair, and skeletal regeneration therapy // J. Cell. Biochem. – 1994. – Vol. 56. – P. 283–294.

5. Jamshidi K., Swaim W.R. Bone marrow biopsy with unaltered architecture: A new biopsy device // J. Lab. Clin.Med. – 1971. – № 77. – Р. 335.

6. Krause J. Bone marrou overview. In: Rodak B, ed. Hematology: Clinical Procedures and Appllications. – 2nd ed. Philadelphia // WB Saunders. – 2002. – Р. 188–195.

7. Shake J. G., Gruber P.J., Baumgartner W.A. et al. Mesenchimal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects // Ann. Thorac.Surg. – 2002. – Vol.73. – P. 1919–1956.

8. Weaver C.V., Garry D.G. Regenerative biology: a historical perspective and modern applications // Regenerative Medicine. – 2008. – Vol. 3, № 1. – P. 63–82.

Ампутации нижних конечностей – это вызов современной медицине. В разных странах мира производится эта инвалидирующая операция. Существенную долю среди них составляют больные сахарным диабетом. Смертность при СД уже не обусловлена острыми осложнениями, такими как гипергликемия, а чаще является следствием хронических осложнений этого заболевания, среди которых наиболее частое – синдром диабетической стопы. По данным статистических исследований, каждые 10–15 лет число людей, болеющих диабетом удваивается. Приблизительно 40–60 % всех нетравматических ампутаций нижних конечностей проводится у больных диабетом. У 80 % больных сахарным диабетом спустя 15–20 лет после начала болезни ампутируются одна или обе нижние конечности. В 40 % наблюдений после первой ампутации на уровне бедра или голени больные теряют подвижность и могут передвигаться только в пределах квартиры. С увеличением возраста больных прослеживается тенденция увеличения доли больших ампутаций, так, у лиц возрастной категории 65–74 года ампутации голени и бедра составляют 32 и 18 %, среди лиц старше 75 лет ‒ 34 и 28 % соответственно. Уровень ампутации определяет летальность. Ампутация конечности – операция, травматичная как для самого больного, так и для его семьи. Высокие ампутации приводят к ограничению социальной адаптации пациентов, существенно сокращают продолжительность жизни больных в результате поражения контралатеральной конечности и присоединения различного рода осложнений. Нижняя конечность, удаляемая во время вынужденной ампутации, ‒ это важное депо костного мозга, где в полости бедренной кости находится около 25 % всего костного мозга данного пациента. Важной особенностью костного мозга является его одновременная принадлежность двум регуляторным системам организма – системе крови и иммунной системе, клетки которых участвуют в обеспечении адаптивных реакций. В настоящее время доказано, что восстановление поврежденного органа происходит не только за счет активации органных регионарных стволовых клеток, но и за счет миграции в зону повреждения мезенхимальных стволовых клеток из других органов, и, прежде всего, из костного мозга. Если при операции, например, ампутации конечности на уровни бедра, удаляется до 25 % всего костного мозга, то возможности к репарации и восстановлению снижены из-за уменьшения количества клеток, отвечающих за это. Иммунная система при ампутации конечности сокращена на четверть, и как долго сохранится созданный иммунодефицит ‒ зависит от индивидуальных особенностей пациента. Важно во время проведения вынужденной ампутации конечности снизить потери костного мозга. Применение тканевых и клеточных технологий уже вышло из разряда доклинических исследований. Ближайшая задача биомедицинских исследований в этой области – применение высоких клеточных технологий [1]. Получение стволовых клеток путем культивирования имеет несколько общеизвестных недостатков и, в первую очередь, опасность отторжения. Большинство известных технологий взятия костного мозга у живых лиц с целью последующей трансплантации ткани костного мозга или выделенного концентрата стволовых клеток предполагает использование методик инвазивной трепанобиопсии [5]. Впервые мезенхимальные стволовые клетки были обнаружены именно в костном мозге и долгое время считалось, что основным депо стволовых клеток является именно костный мозг. В последние годы во всем мире началось интенсивное изучение стволовых клеток из различных источников. Было показано, что стволовые клетки присутствуют в любой ткани и органе: в печени, селезенке, жировой ткани и пр. Вместе с тем в практике хирургических стационаров достаточно часто приходится иметь дело с необходимостью проведения ампутаций конечностей. По статистическим данным, в США ампутации нижних конечностей ежегодно проводятся примерно у 150000 человек [2]. Предполагается, что среди прочих равных обстоятельств определенное значение в этом имеет и факт утраты вместе с костно-мозговой тканью, находящейся в ампутированной кости, до 25 % всего количества стволовых клеток пациента [3]. Полученную в результате вынужденной операции костно-мозговую ткань следует рассматривать как один из возможных источников стволовых клеток, в том числе и с целью последующей аутотрансплантации. В настоящее время клеточная терапия применяется при многих заболеваниях, которые ранее считались неизлечимыми. Лечение стволовыми клетками возможно при 1 и 2 типе сахарного диабета. Для лечения сахарного диабета применяются стволовые клетки, полученные из костного мозга. Цель лечения диабета – предупреждение его осложнений, снижение уровня вводимого инсулина и нормализация уровня глюкозы крови. При получении стволовых клеток из ампутированной конечности (что часто наблюдается при сахарном диабете) можно использовать их для данного больного с целью улучшения качества его жизни и профилактики осложнений диабета.

Целью исследования является демонстрация возможности выделения стволовых клеток, полученных из костного мозга бедренной кости ампутированной конечности. Провести сравнительную оценку полученных результатов с традиционной костно-мозговой пункцией. Поставленную задачу решают за счет того, что в операционной непосредственно после ампутации извлекают костный мозг из костно-мозгового канала бедренной кости в стерильную емкость с последующей транспортировкой в лабораторию.

Выделение клеток костного мозга: костномозговую массу объемом 3 мл гомогенизировали в 4 мл PBS. Полученную суспензию пропускали через нейлоновый фильтр с порами 40 мкм. Три раза клетки отмывали PBS-центрифугированием 5 мин при 900 g. Клетки разводили PBS до конечной концентрации 600 тыс. в 1 мл. Определение CD34 + клеток: CD34 + определяли на проточном цитофлюориметре BD FACS Canto II по стандартной методике. В качестве флюоресцентной метки использовались меченые FITC антитела (BD) к CD34, отрицательный контроль – антитела, меченные FITC к мышиным IgG1 (BD). CD34 + клетки считали от числа всех клеток в суспензии [6].

Как мы видим из таблицы, содержание стволовых клеток в костном мозге, полученном из ампутированной конечности, намного выше, чем количество стволовых клеток, полученных при пункции.

Количество стволовых клеток, полученных при пункции, не превышает 0,1 % [3], а количество стволовых клеток, полученных из ампутированной конечности, больше в несколько раз (от 2 до 38 раз).

Содержание стволовых клеток в костном мозге ампутированной конечности больных

Заключение

1) большой объем костного мозга (в сравнении с пункцией);

2) техническая простота взятия материала;

3) высокое содержание стволовых клеток в костном мозге ампутированной конечности (возможность клеточной терапии без культивирования);

4) больной не подвергается пункции.

Ни один из существующих на данный момент источников СК человека или методов их получения не может полностью обеспечить потребности исследователей и требования клиницистов. Получение взрослых СК ассоциировано с применением инвазивных, травмирующих, болезненных для донора (не без риска осложнений) и, что немаловажно, дорогостоящих процедур. Все это, безусловно, ограничивает экспериментальные исследования СК человека и тормозит внедрение клеточных технологий в клиническую практику [1]. Ампутированную конечность, полученную в результате вынужденной операции, можно рассматривать как один из наиболее доступных источников стволовых клеток, в том числе и мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Способность к дифференцировке в различные клеточные типы делает МСК перспективными с точки зрения возможного использования для клеточной терапии целого ряда приобретенных и наследственных заболеваний. При введении в системный кровоток МСК способны целенаправленно мигрировать в участок поражения [8].

Можно неинвазивным методом получить большое количество материала для выращивания стволовых клеток, а также быстро создать банк стволовых клеток костного мозга и подбирать в будущем гистосовместимых доноров. Применение аутотрансплантации МСК кажется наиболее перспективным на данном этапе развития клинической науки, так как оно позволяет избежать этических и иммунных проблем, связанных с трансплантацией от донора к реципиенту. Кроветворные стволовые клетки уже на протяжении трех десятилетий используются для восстановления кроветворения у пациентов с онкологическими и гематологическими заболеваниями. Активно разрабатываются подходы к применению трансплантации стволовых клеток при лечении заболеваний, которые до последнего времени считались неизлечимыми с помощью традиционных подходов [8]. Внедрение клеточных технологий в клиническую практику является актуальной задачей современной медицины.

Рецензенты:

Сухоруков А.М., д.м.н., профессор, старший научный сотрудник НИИ медицинских проблем Севера, г. Красноярск;

Никифоров С.Б., д.м.н., профессор, старший научный сотрудник института «Хирургия», г. Иркутск.

Работа поступила в редакцию 01.07.2013.

Библиографическая ссылка