Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

STUDY OF ANTIINFLAMMATORY ACTIVITY OF LIPOIC ACID IN ADJUVANT-INDUCED ARTHRITIC RATS

Imanaeva A.Y. 1 Zalyalyutdinova L.N. 1 Tsyplakov D.E. 1
1 Kazan State Medical University
Lipoic acid is a unique potent antioxidant with a pronounced antiinflamatory activity. We have designated this study to evaluate antirheumatoid activity of lipoic acid in comparison with sodium diclofenac at oral administration in rat adjuvant-induced arthritis. At lipoic acid doses ranging from 1/10 DL50 to 1/200 DL50, a strongest effect was with 1/100 DL50. For this reason in a comparative study the dose used for lipoic acid was 1/100 LD50, and a mean effective dose for sodium diclofenac. The efficacy of therapy was evaluated by means of the following tests: oncometry for paw volume, infrared thermography for local surface temperature and pathomorphological staining of involved joints. We found that lipoic acid at oral administration down-regulates adjuvant-induced inflammation signs, i.e. paw oedema and hyperthermia in a higher extant than sodium diclofenac. Pathomorphological study showed that lipoic acid markedly down-regulates major features of adjuvant arthritis – synovial hyperplasia and bone destruction. These results prove the necessity of further clinical phase of studies of lipoic acid antirheumatoid activity in order to invent a new drug for rheumatoid arthritis with high efficacy and safety.
lipoic acid
adjuvant arthritis
IR-thermography
pathomorphology
1. Zalyalyutdinova L.N., Sabirova A.Ya. Vliyanie lipoevoy kisloty na techenie adyuvantnogo artrita [Influence of lipoic acid on adjuvant arthritis]. Farmakologiya i toksikologiya fosfororganicheskikh soedineniy I drugikh biologicheski aktivnykh veschestv.Mat. konf.; 2008; no. 4
2. Korzhevskiy D.E. Kratkoe izlozhenie osnov gistologicheskoy tekhniki dlya vrachey I laborantov-gistologov [Brief review of the basics of histological technics for doctors and laboratory assistant histologists]. Saint-Petersburg, Krof Publ., 2005; 48p.
3. Pakht A.V., Manizer N.M. Osobennosti obrabotki kostnoy tkani. Biblioteka patologoanatoma (nauchno-praktich. zhurnal). 2008; рр. 6–11.
4. Canter P.H., Wider B. and Ernst E. The antioxidant vitamins A, C, E and selenium in the treatment of arthritis: a systematic review of randomized clinical trials. Rheumatology 2007;46:1223–1233
5. Hitchon C.A., El-Gabalawy H.S. Oxidation in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2004, 6:265–278
6. Newbould B.B. Chemotherapy of arthritis induced in rats by mycobacterial adjuvant. Brit. J. Pharmacol. (1963), 21, 127–136
7. Rosenbaum C.C., O’Mathúna D.P., Chavez M., Shields K. Altern Ther Health Med. 2010 Mar-Apr;16(2):32–40

Роль оксидативного стресса в патогенезе РА не вызывает сомнений [5]. В настоящее время появляются данные о наличии антиревматоидных свойств различных антиоксидантов, в частности, селена, фуллеренов, витаминов А, С и Е, омега-3-полиненасыщенных жирных кислот [4, 7].

Цель исследования – изучение противовоспалительной активности антиоксиданта липоевой кислоты в сравнении с диклофенаком натрия на модели адъювантного артрита крыс при пероральном и местном применении.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования явилась субстанция липоевой кислоты, синтезированная в ОАО «ICN МАРБИОФАРМ» [ФСП 420035029200]. Проведенные исследования антиревматоидной активности липоевой кислоты и препарата сравнения диклофенака натрия были представлены на экспертизу и одобрены Локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета.

Оценка влияния липоевой кислоты на аутоиммунное воспаление проводилась на модели адъювантного артрита крыс, предложенной B.B. Newbould [6]. В экспериментах использовались 246 половозрелых нелинейных крыс массой 230 ± 15 г. Воспалительная реакция моделировалась путем субплантарного введения в правую заднюю лапу крыс 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда (Sigma). Исследуемые вещества (суспензия липоевой кислоты в диапазоне доз от 1/10 до 1/200 ЛД50 в крахмальном растворе, водный раствор диклофенака натрия в среднеэффективной дозе) вводились внутрижелудочно с помощью зонда ежедневно однократно с 12-го дня эксперимента в течение 14 дней. Выраженность воспалительной реакции оценивалась на 0, 3, 6, 10, 15, 20, 25-й дни эксперимента в динамике: степень воспалительного отека лап оценивалась в динамике онкометрически, а воспалительной гипертермии – в динамике с помощью ИК-термографии при комнатной температуре в закрытом помещении с применением компьютерного тепловизора ИРТИС-2000 С (г. Москва, сертификат № 29469 от 2007 г.). На термограммах в области, анатомически соответствующей области голеностопных суставов лап крыс, выделялся квадрат со стороной 5 мм, внутри которого программой IR Preview высчитывалась средняя температура.

Патоморфологическое исследование. Животные, ткани и органы которых должны были подвергнуться патоморфологическому исследованию, получали полноценный уход вплоть до момента эвтаназии, содержались в отдельном помещении и не были свидетелями умерщвления других животных. Забой осуществлялся под поверхностным эфирным наркозом в специальной камере в теплом помещении. Изготовление гистологических препаратов проводили по методике, разработанной для костных тканей [2, 3]. Для этого осуществлялась фиксация материала в 10 % нейтральном формалине, затем следовала промывка в проточной водопроводной воде в течение 24 часов и декальцинация в смеси из 100 мл 90 % муравьиной кислоты, 80 мл 40 % соляной кислоты и 820 мл водопроводной воды. Жидкость меняли каждые 48 часов. Декальцинация продолжалась в среднем 10–15 дней. После промывки в течение 24 часов в водопроводной воде материал обезвоживали в батарее спиртов возрастающей концентрации 70 % (3 порции), 96 % (две порции), 100 % (одна порция), где выдерживали 1 сутки в каждой порции. Обезвоженные образцы последовательно помещали в раствор спирта и хлороформа 1:1 (3–5 часов), две порции хлороформа (по 1 часу) и помещали в в термостат при 37 °С в смесь хлороформа и парафина 1:1 (2–3 часа). Затем в термостате при 56 °С материал пропитывался в двух порциях парафина (1 час в первой и 24 часа во второй). По окончании проводки осуществлялась заливка в парафин, охлаждение и изготовление срезов толщиной 7–10 мкм на микротоме. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по ван Гизону. Микроскопическое изучение объектов проводилось с использованием микроскопа Axioscop «Цейс».

Полученные результаты обрабатывались статистически с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows с вычислением средней арифметической, ошибки средней, t-критерия Стьюдента; критерием достоверности отличий явилось значение р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В контрольной группе животных первичная воспалительная реакция – отек правой лапы – начинала формироваться на 3-й день после введения адъюванта и сохранялась до конца эксперимента. Вторичная иммунологическая реакция – воспаление контрлатеральной (левой) задней лапы – начинала формироваться на 11-й день эксперимента и достигала максимума к концу эксперимента (на 25-й день).

Введение в качестве плацебо дистиллированной воды и крахмального раствора животным с моделированным артритом не приводило к достоверному снижению отека лап. Прирост объема правой лапы по сравнению с исходным к концу эксперимента был принят за 100 % первичной воспалительной реакции. Прирост объема левой лапы к концу эксперимента по сравнению с исходным был принят за 100 % вторичной иммунологической реакции (табл. 1).

При изучении специфической активности липоевой кислоты в дозах, соответствующих от 1/10 до 1/200 ЛД50, было выявлено, что липоевая кислота наиболее эффективна в дозе, соответствующей 1/100 ЛД50 [1].

При сравнении антиревматоидной активности липоевой кислоты и диклофенака натрия было выявлено, что на 25-е сутки диклофенак натрия достоверно снижал первичную воспалительную реакцию на 40 %, вторичную иммунологическую реакцию – на 24 %. Липоевая кислота достоверно уменьшала воспаление в правой лапе на 89 %, а в контрлатеральной – лапе на 92 %.

Таблица 1

Влияние липоевой кислоты и диклофенака натрия при пероральном применении на прирост объема правой и левой лап крыс с адъювантным артритом к концу эксперимента, мл

Группа

Контроль

Диклофенак натрия, 8 мг/кг

Липоевая кислота, 11 мг/кг

М ± mа

%

М ± mа

%

М ± mа

%

Правая лапа

1,78 ± 0,279

100

1,11 ± 0,154*

60

0,20 ± 0,035* **

11

Левая лапа

1,13 ± 0,124

100

0,86 ± 0,208*

76

0,09 ± 0,012* **

8

Примечания:

* – р < 0,05 по сравнению с контрольной группой;

** – р < 0,05 по сравнению с группой животных, леченных диклофенаком натрия.

Методом ИК-термографии было выявлено, что на 3-й день после введения адъюванта отмечается повышение температуры лапы в области введения полного адъюванта Фрейнда в среднем на 4,8 ± 0,63 °С (рис. 1), на 11-й день эксперимента нами выявлена гипертермия в контралатеральной лапе и прирост средней температуры составил 4,2 ± 0,51 °С (рис. 2).

Курсовое применение липоевой кислоты в дозе 10 мг/кг и диклофенака натрия в дозе 8мг/кг привело к достоверному снижению адъювант-индуцированной гипертермии обеих лап. Так, курсовое применение диклофенака натрия достоверно снизило среднюю температуру в правой задней конечности на 46 %, в левой конечности – на 45 %. Курсовое применение липоевой кислоты привело к уменьшению гипертермии, сопровождавшей первичную воспалительную реакцию, на 70 %, а гипертермии, сопровождающей вторичную иммунологическую реакцию, на 74 %, что достоверно превосходило эффективность диклофенака натрия.

pic_63.tif

Рис. 1. ИК-термограмма лап крыс на 3-й день после введения полного адъюванта Фрейнда. Развитие первичной воспалительной реакции

pic_64.tif

Рис. 2. ИК-термограмма лап крыс на 11-й день после введения полного адъюванта Фрейнда. Развитие вторичной иммунологической реакции

Таблица 2

Влияние липоевой кислоты и диклофенака натрия при пероральном применении на прирост температуры правой и левой лап крыс с адъювантным артритом к концу эксперимента, °С

Группа

Контроль

Диклофенак натрия, 8 мг/кг

Липоевая кислота, 11 мг/кг

М ± mа

%

М ± mа

%

М ± mа

%

Правая лапа

4,6 ± 0,49

100

2,5 ± 0,43 *

54

1,4 ± 0,21 * **

30

Левая лапа

4,2 ± 0,32

100

2,3 ± 0,39 *

55

1,1 ± 0,25 * **

26

Патоморфологическое исследование показало, что введение адъюванта Фрейнда привело к развитию выраженной воспалительной реакции, захватывающей как сам сустав, так и периартикулярные ткани, включая кожный покров. В дерме и подлежащих тканях обнаруживались очаговые или диффузные лимфогистиоцитарные инфильтраты. Наблюдалась отслойка эпидермиса, а в тяжелых случаях – десквамация эпителия с некрозом дермы, включая ее железы и волосяные фолликулы. Суставная поверхность кости имела неровную выстилку с наличием дефектов, образованных за счет деструкции хряща, которые чередовались с участками пролиферации хрящевой ткани (рис. 3). В ряде наблюдений, при наличии значительных эрозий хряща, в подлежащей кости имели место явления остеопороза и некротические изменения. Синовиальная оболочка была резко утолщена, отечна и гиперемирована. Структура ее, как правило, не определялась из-за тотальной инфильтрации ее лимфоцитами, плазмоцитами и клетками макрофагального ряда. В некоторых случаях в воспалительном инфильтрате преобладали нейтрофилы вплоть до образования обширных лейкоцитарно-некротических масс с деструкцией синовиальной оболочки.

Пероральное применение диклофенака натрия существенно снижало воспалительную реакцию в суставе. Несмотря на отсутствие грубых изменений кожного покрова, в некоторых наблюдениях определялись очаги некроза в периартикулярных тканях.

Пероральное применение липоевой кислоты также приводило к уменьшению или отсутствию воспаления как в суставе, так и в периартикулярных тканях. Кожный покров имел обычную гистологическую структуру. Хрящевая поверхность была гладкой, с четко определяемыми зонами и наличием неизмененных хондроцитов. Подлежащая костная ткань была представлена компактной костью с наличием небольших грубоволокнистых фрагментов балочного строения. В случаях деструкции кости в результате воспалительной реакции применение липоевой кислоты сопровождалось восстановлением костной ткани. Это реализовалось путем разрастания соединительной ткани, трансформации ее в хрящ, из которого в свою очередь образовывались новые костные балки. Синовиальная оболочка в целом имела нормальное гистологическое строение (рис. 3). Только в единичных случаях сохранялись явления умеренного отека и незначительная очаговая лимфогистиоцитарная инфильтрация.

pic_65.tif

Рис. 3. Слева – дефекты хрящевой выстилки: чередование зон деструкции и пролиферации хряща с оголением участков подлежащей кости в контрольной группе. Окраска гематоксилином и эозином. х200. Справа – нормальная трехслойная хрящевая выстилка и неизмененная подлежащая костная ткань в группе животных, леченных липоевой кислотой. Окраска гематоксилином и эозином. х400

Заключение

Таким образом, нами было впервые показано, что липоевая кислота при пероральном применении на модели адъювант-индуцированного артрита крыс эффективно подавляет развитие как первичной воспалительной, так и вторичной иммунологической реакции, устраняет повреждения суставных тканей, в частности, синовиальной оболочки, суставного хряща и костной ткани, вызванных введением адъюванта Фрейнда, и по эффективности превосходит эталонное противовоспалительное средство.

Рецензенты:

Гараев Р.Р., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии, ГБОУ ВПО «Казанский ГМУ Минздрава России», г. Казань;

Семина И.И., д.м.н., профессор, заведующая ЦНИЛ, ГБОУ ВПО «Казанский ГМУ Минздрава России», г. Казань.

Работа поступила в редакцию 02.04.2013.