Эндометриоз в последние годы прочно занял лидирующие позиции в структуре гинекологических заболеваний, поражая от 5 до 50 % женщин репродуктивного возраста и являясь наиболее частой причиной бесплодия [1, 2, 8]. Эндометриоз характеризуется разрастанием ткани, подобной эндометрию, за пределами полости матки в результате избыточной пролиферации на фоне гормонального дисбаланса. Этиология и патогенез данной патологии до конца не выяснены, однако показано, что в развитии эндометриоза существенную роль играют генетические факторы [1, 7, 8].
Современные исследователи склонны расценивать автономный рост очагов эндометриоза как результат отсутствия адекватного контроля за пролиферацией и дифференцировкой клеток гетеротопий со стороны организма женщины. Эндогенная и экзогенная регуляция апоптоза, уравновешивающего эффекты клеточной пролиферации, элиминации поврежденных и функционально неполноценных клеток, является актуальным аспектом исследований патогенеза эндометриоза [7, 8, 10].
Установлено, что эндометриоидные клетки не находятся в «пролиферативном хаосе», они переходят на интра-, ауто- и паракринный механизмы регуляции своего роста, что выражается в утрате контактного торможения и иммортализации [1, 10]. Очаги эндометриоза становятся непосредственными продуцентами факторов роста, цитокинов, онкобелков при отсутствии экспрессии гена-супрессора p53, инициируя нарушения равновесия органов и тканей брюшной полости, усугубляя имеющийся иммунодефицит. Формируется порочный круг, способствующий приживлению новых частиц эндометриоидной ткани, распространению уже имеющихся эктопий, формированию глубокоинвазивных и распространенных форм эндометриоза [1, 7].
Поиск молекулярно-биологических маркеров может дать дополнительную информацию о биологическом поведении эндометриоидных гетеротопий: скорости роста, способности к инвазии и рецидивированию. Активно обсуждается прогностическое значение полиморфных вариантов и мутаций генов-маркеров апоптоза, ангиогенеза, пролиферации при эндометриозе. В связи с этим целью настоящего исследования явилось выявление ассоциации полиморфных вариантов гена р53 с риском возникновения и неблагоприятного течения генитального эндометриоза.
Материал и методы исследования
В программу исследования вошли 300 женщин репродуктивного возраста, проживающих на территории Томской области и г. Томска, находившихся на стационарном лечении в гинекологической клинике ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России. Основную группу составили 200 женщин с наружным генитальным эндометриозом. В группу контроля включено 100 женщин, которым проводилась диагностическая лапароскопия по поводу синдрома хронической тазовой боли, бесплодия и у которых не было выявлено органической патологии, а также женщины, которым проводилась добровольная хирургическая стерилизация. Всем женщинам была проведена лапароскопия по стандартной методике с использованием аппаратуры фирмы «KarlStorz» (Германия) и последующим гистологическим исследованием операционного материала. У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор венозной крови и использование её для проведения исследований. Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях утром в день операции. Выделение ДНК из периферической крови проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия). Определение вариантных генотипов гена p53 С72G осуществляли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров к участку гена (forward 5’-ATG-AAG-CTC-CCA-GAA-TGC-3 и reverse: 5’-GCC-GGT-GTA-GGA-GCT-3’) и зондов, комплиментарных участку в амплифицируемой ДНК (5’-FAM-CTG-CTC-CCC-GCG-TGG-CCC-3’ и 5’-ROX-CTG-CTC-CCC-CCG-TGG-CCC-3’). Смесь для амплификации (15 мкл) содержала 100–200 нг ДНК, 2,5 нМ каждого праймера, 2,0 нМ каждого зонда, 1 мМ смесь четырёх dNTP, 1мМ MgCl2, 0,8 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы («Лаборатория Медиген», Россия) и 10×буфер, поставляемый производителем в наборе с ферментом. Программа амплификации включала 1 мин предварительной денатурации при 94 °С и 42 цикла: 94 °С – 10 с, 58 °С – 15 с, 72 °С – 10 с. Кривые накопления флуоресцентного сигнала анализировались с помощью программного обеспечения амплификатора ДТ-96 («ДНК-технология», Россия).Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных алгоритмов биометрии. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди‒Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с эндометриозом сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах больных и здоровых индивидов, используя критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. При численностях генотипов менее пяти использовали точный тест Фишера.
Результаты исследования и их обсуждение
Сохранение целостности и первоначальной структуры ДНК невозможно без участия регуляторов клеточного цикла, обеспечивающих баланс в продвижении клетки по циклу и смены одной фазы на другую. Сбалансированное регулирование смены клеточного цикла обеспечивает нормальное функционирование всех систем клетки [3]. Одним из ключевых генов, обеспечивающих стабильность генома, является ген р53, кодирующий белок Р53, вовлеченный в регуляцию путем остановки клеточного цикла в контрольных точках для осуществления репарации ДНК, либо индукции апоптоза в случае невозможности устранения повреждений [4, 5]. Наличие полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, обеспечивает индивидуальную особенность в восприимчивости клетки и организма в целом к факторам внешней и внутренней среды и другим особенностям реализации метаболических, репаративных и митотических событий [4, 5, 6, 9].
Результаты проведенного нами исследования по изучению распределения аллелей и генотипов полиморфизма G72C гена р53 у женщин без эндометриоза позволили зарегистрировать преобладание генотипа GG (70 %) над СG (30 %), при этом гомозиготный генотип по аллелюC выявлен не был (табл. 1).
Таблица 1
Распределение генотипов и аллелей полиморфизма G72C гена р53 (абс., %) у женщин с генитальным эндометриозом
|
Генотипы и аллели полиморфизма G72C гена р53 |
Характеристика обследованных лиц |
χ2, p |
OR (95 % CI) |
|
|
Женщины без эндометриоза n = 100 |
Женщины с эндометриозом n = 200 |
|||
|
GG |
70 (70,00) |
110* (55,00) |
10,90 p < 0,05 |
0,52 (0,31–0,87) |
|
GC |
30 (30,00) |
70 (35,00) |
1,26 (0,75–2,11) |
|
|
CC |
0 (0,00) |
20* (10,00) |
22,83 (1,37–381,47) |
|
|
G |
15 (15,00) |
55(27,50) |
11,65 p < 0,05 |
2,50 (1,38–3,36) |
Примечание: n – количество человек в группе. Анализ качественных независимых данных проводили с помощью критерия χ2 Пирсона. р – уровень статистической значимости различий между группами. * – статистически значимые различия относительно соответствующего показателя у здоровых женщин. Статистически значимые различия считали при р < 0,05. OR – критерий отношения шансов, отражающий относительный риск развития заболевания при определенном генотипе по сравнению с группой контроля с 95 % доверительным интервалом.
У женщин с генитальным эндометриозом распределение генотипов полиморфного сайта G72C гена р53 оказалось аналогичным: преобладал генотип GG (55 %), реже встречался генотип GC (35 %). Однако обращало на себя внимание, что редкий генотип CC был выявлен у 10 % женщин с генитальным эндометриозом (табл. 1).
При сравнительной оценке распределения генотипов и аллелей полиморфного участка G72C гена р53 у женщин с генитальным эндометриозом наблюдалось снижение частоты генотипа GG и появление генотипа CC (χ2 = 10,90, p < 0,05) и преобладание редкого аллеля C (χ2 = 11,65, p < 0,05). Кроме того, была показана положительная ассоциация генитального эндометриоза с аллелем С (OR = 2,50) и генотипом СС (OR = 22,83) полиморфизма G72C гена р53. ГенотипGG (OR = 0,52) обладал протективным эффектом в отношении генитального эндометриоза (см. табл. 1).
Для оценки распределения аллелей и генотипов изучаемого нами полиморфизма G72C гена р53у больных генитальным эндометриозом в зависимости от степени распространения процесса проводили исследование, предварительно разделив пациенток на две группы согласно классификации Американского общества фертильности R-AFS (1985г.). Результаты оценки распределения приведены в табл. 2.
Таблица 2
Распределение генотипов и аллелей полиморфизма G72C гена р53 (абс., %) у женщин с генитальным эндометриозом различной степени распространения (R-AFS, 1985 г.)
|
Генотипы и аллели полиморфизма G72C гена р53 |
Характеристика обследованных лиц |
||
|
Женщины без эндометриоза n = 100 |
Женщины с эндометриозом 1–2 ст. n = 107 |
Женщины с эндометриозом 3–4 ст. n = 93 |
|
|
GG |
70(70,00) |
67 (62,60) |
43*# (46,20) |
|
OR (95 % CI) |
0,72 (0,40–1,28) |
0,37 (0,20–0,67) |
|
|
GC |
30 (30,00) |
35 (32,7) |
35 (37,60) |
|
OR (95 % CI) |
1,13 (0,63–2,04) |
1,41 (0,77–2,56) |
|
|
CC |
0(0,00) |
5 (4,70) |
15*#(16,10) |
|
OR (95 % CI) |
10,79 (0,59–197,62) |
39,69 (2,34–673,64) |
|
|
χ2, р |
5,22 p > 0,05 |
21,61 p < 0,05 |
|
|
G |
15 (15,00) |
22 (21,00) |
32 (34,90) |
|
χ2, р |
2,53 p > 0,05 |
20,67 p < 0,001 |
|
|
OR (95 % CI) |
1,51 (0,91–2,51) |
3,04 (1,86–4,98) |
|
Примечание: n – количество человек в группе. Анализ качественных независимых данных проводили с помощью критерия χ2 Пирсона. р – уровень статистической значимости различий между группами. * – статистически значимые различия относительно соответствующего показателя у здоровых женщин. # – статистически значимые различия относительно соответствующего показателя у женщин с эндометриозом 1–2 степени распространения процесса. Статистически значимые различия считали при р < 0,05. OR – критерий отношения шансов, отражающий относительный риск развития заболевания при определенном генотипе по сравнению с группой контроля с 95 % доверительным интервалом.
Было выявлено, что среди пациенток, страдающих генитальным эндометриозом 3‒4 степени распространения процесса, имелись значимые различия в распределении аллелей (χ2 = 20,67, р < 0,001) и генотипов (χ2 = 21,61, р < 0,05) данного полиморфного сайта относительно группы контроля (табл. 2). Отмечалось значимое снижение частоты встречаемости генотипаGG и увеличение генотипа СС полиморфного сайта G72C гена р53 как по сравнению с женщинами без эндометриоза, так и с женщинами с генитальным эндометриозом 1‒2 степени распространения (р < 0,05) (см. табл. 2).
Выявлена также положительная ассоциация тяжёлого течения эндометриоза с аллелем С (OR = 3,04) и генотипом СС (OR = 39,69) полиморфизма G72C гена р53. Генотип GG имел протективное значение в отношении 3–4 степени распространения генитального эндометриоза (OR = 0,37) (см. табл. 2).
Таким образом полученные нами результаты свидетельствуют о том, что риск развития генитального эндометриоза ассоциирован с наличием в генотипе женщины аллеля С и генотипа СС полиморфного варианта G72C гена р53. Подверженность тяжелому течению генитального эндометриоза (3–4 степень распространения процесса) статистически связана с аллелем С и генотипом СС полиморфизма G72C гена р53.
Согласно полученным данным относительно распределения полиморфных вариантов гена клеточного цикла у больных генитальным эндометриозом было выявлено значимое увеличение частоты встречаемости «патологического» аллеля С гена р53, выполняющего центральную регуляторную функцию в клеточном цикле, зачастую именуемого в литературе «хранителем генома» [10]. Аналогичные результаты были получены в популяции бразильских и мексиканских женщин, больных генитальным эндометриозом [5, 9], однако у индийских пациенток с данной патологией ассоциации эндометриоза с «патологическим» аллелем гена р53 обнаружено не было [6].
Основная функция р53 состоит в остановке клеточного цикла и увеличении продолжительности премитотической фазы для осуществления репарационного синтеза. Активированный белок Р53 способен через несколько механизмов влиять на регуляцию клеточного цикла [3, 4, 5, 10]. Опосредованно с белком Р21 он участвует в остановке клеточного цикла в точке перехода фазы G1 в S и запуске репарационных событий, взаимодействуя с белками DDB2 и GADD45A, тормозит прохождение клетки по клеточному циклу; регулирует гибель клетки как через рецепторы, непосредственно запускающие вешний путь апоптоза, (Fas/Apo-1, DR5, DR10, DR11), так и через проапоптотические регуляторные механизмы внутреннего пути (Bcl-2, Bax, PUMA, Noxa, Bid, каспазы-6, Apaf-1, PIDD) [3, 10].
Важной функцией р53 является также регуляция взаимодействия с окружающими клетками и воспринимаемыми клеткой эндокринных и паракринных сигналов. Показано, что увеличение содержания белка р53 или отдельных продуктов генов, экспрессия которых находится под контролем р53, приводит к блоку сигнального пути, ответственного за восприятие транскрипционных факторов [5, 9, 10].
Влияние минорного варианта гена р53 заключается в ослаблении контроля за продвижением по клеточному циклу и предопределяет тем самым снижение качества репарации ДНК аппарата клетки [4, 9]. Зачастую у пациенток с эндометриозом мутации гена p53 на фоне повышения экспрессии онкогенов –С-myc, С-fos – приводят к усилению пролиферации эндометриоидных клеток с возможной злокачественной трансформацией.
Рецензенты:
Воронкова О.В., д.м.н., профессор кафедры патофизиологии, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Томск;
Куценко И.Г., д.м.н., профессор кафедры акушерства и гинекологии, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Томск.
Работа поступила в редакцию 14.02.2013.