Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

NORADRENALINE RESISTANCE IN ADIPOCYTES OF MICE WITH OBESITY AND TYPE 2 DIABETES

Turovsky E.A. 1 Turovskaya M.V. 1 Tolmacheva A.V. 1 Dolgacheva L.P. 1 Zinchenko V.P. 1 Dynnik V.V. 1, 2
1 Institute of Cell Biophysics
2 Institute of Theoretical and Experimental Biophysics
The study was carried out in cultured mouse adipocytes of white adipose tissue. Preadipocytes were isolated from healthy animals and mice with obesity and type 2 Diabetes. Using an Oil red staining we show that the triacylglycerol pools were formed on 3–9 day in vitro over a glucose in adipocytes from healthy mice. The triacylglycerol pools are not observed in cultured adipocytes for mice with type 2 Diabetes. Addition in the incubation medium of 1 µM palmitoyl carnitine initiated the triacylglycerol pools in cultured adipocytes for mice with type 2 Diabetes. The amplitude of the Са2+-response on noradrenaline was much lower in adipocytes from obese mice in comparison with control animals. Addition in the incubation medium of 100 nM palmitoyl carnitine restored of the Са2+-responses on noradrenaline in adipocytes (9DIV) which were isolated from mice with obesity and type 2 Diabetes.
adipocytes
norepinephrine
Са2+
II type diabet
palmitoil carnitine
pool of triglyceride
1. Brooks B., Arch J.R.S., Newsholme E.A. Effects of hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty acid substrate cycle in adipocytes and epididymal fat pads. // FEBS Lett. 1982. Vol. 146. рр. 327–330.
2. Clark H., Carling D., Saggerson D. Covalent activation of heart AMPactivated protein kinase in response to physiological concentrations of long-chain fatty acids. // Eur. J. Biochem. 2004. Vol. 271. рр. 2215–2224.
3. Edens N.K., Leibel R.L., Hirsch J. Mechanism of free fatty acid reesterification in human adipocytes in vitro // J. Lipid Res. 1990. Vol. 31. рр. 1423–1431.
4. El-Hayek R., Valdivia C., Valdivia H. H., Hogan K., Coronado R. Activation of the Ca2+ release channel of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum by palmitoyl carnitine // Biophys J. 1993. Vol. 65, no. 2. рр. 779–789.
5. Fediuc S., Gaidhu M.P., Ceddia R.B. Regulation of AMP-activated protein kinase and acetyl-CoA carboxylase phosphorylation by palmitate in skeletal muscle cells // J. Lipid Res. 2006. Vol. 47. рр. 412–420.
6. Kurth-Kraczek E.J., Hirshman M.F., Goodyear L.J., Winder W.W. AMP-activated protein kinase activation causes GLUT4 translocation in skeletal muscle // Diabetes 1999. Vol. 48, no. 5. рр. 1667–1671.
7. Langin D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome // Pharmacological Research 2006. Vol. 53. pp. 482–491.
8. Dumonteil E., Barré H., Meissner G. Effects of palmitoyl carnitine and related metabolites on the avian Ca(2+)-ATPase and Ca2 + release channel // J Physiol. 1994. Vol. 479, no. 1. pp. 29–39.
9. Piwkowska A., Rogacka D., Angielski S., Jankowski M. Hydrogen peroxide induces activation of insulin signaling pathway via AMP-dependent kinase in podocytes. // Biochem Biophys Res Commun. 2012. Vol. 428, no. 1. pp. 167–172.
10. Rosen E.D., Spiegelman B.M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis // Nature. 2006. Vol. 444. pp. 847–853.
11. Tavernier G., Jimenez M., Giacobino J. P., Hulo N., Lafontan M., Muzzin P., Langin D. Norepinephrine induces lipolysis in beta1/beta2/beta3-adrenoceptor knockout mice // Mol Pharmacol. 2005. Vol. 68. pp. 793–799.
12. Trayhurn P. Endocrine and signalling role of adipose tissue: new perspectives on fat // Acta Physiol. Scand. 2005.Vol. 184. pp. 285–293.
13. Turovsky E.A., Turovskaya M.V., Berezhnov A.V., Tolmacheva A.V., Kaimachnikov N.P., Dolgacheva L.P., Zinchenko V.P., Maevskii E.I., Dynnik V.V. Convergence of Ca2+-signaling pathways in adipocytes. The role of L-arginine and protein kinase G in generation of transient and periodic Ca2+-signals // Biochemistry (Moscow). 2012. Vol. 6, № 1. pp. 35–44.
14. Watt M.J., Steinberg G.R., Chen Z.P., Kemp B.E., Febbraio M.A. Fatty acids stimulate AMP-activated protein kinase and enhance fatty acid oxidation in L6 myotubes. // J. Physiol. 2006. Vol. 574. pp. 139–147
15. Weber J.M., Reidy S.P. Extending food deprivation reverses the short-term lipolytic response to fasting: role of the triacylglycerol/fatty acid cycle // J Exp Biol. 2012. Vol. 215, no. 9. pp. 1484–1490.
16. Yang J., Holman G.D. Insulin and contraction stimulate exocytosis, but increased AMP-activated protein kinase activity resulting from oxidative metabolism stress slows endocytosis of GLUT4 in cardiomyocytes // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280. pp. 4070–4078.

Белая жировая ткань играет главную роль в поддержании энергетического гомеостаза организма при голодании и физической нагрузке за счет липолиза запасенных триглицеридов. В результате липолиза происходит расщепление триглицеридов и высвобождение жирных кислот и глицерола. Эволюционно этот процесс обеспечивает выживание в условиях длительного отсутствия пищи. Жировая ткань является важным метаболическим органом, который играет решающую роль в инсулиновой чувствительности и энергетическом гомеостазе всего организма [10]. Жировые клетки секретируют несколько типов адипокинов, которые регулируют физиологические процессы во всем организме (включая метаболизм глюкозы, аппетит, воспалительные ответы, ангиогенез, давление и репродуктивную функцию). При ожирении наблюдаются нарушения в экспрессии адипокинов и утилизации глюкозы и липидов, поступающих из пищи, что способствует развитию гипергликемии, гиперлипидемии, инсулиновой резистентности и хроническому воспалению [12]. Таким образом, дисфункция белой жировой ткани при ожирении является важным фактором в патогенезе диабета 2-го типа (D2Т) и других метаболических болезней. Два противоположных процесса, липогенез и липолиз, участвуют в энергетическом гомеостазе. В результате липогенеза клетка запасает триглицериды. Длинноцепочечные неэтерифицированные жирные кислоты (предшественники триглицеридов) образуются:

1) в результате гидролиза липопротеинов плазмы;

2) за счет синтеза de novo в адипоцитах;

3) за счет реутилизации образовавшихся свободных жирных кислот в результате липолиза [1; 3; 15].

Другим предшественником триглицеридов является глицерол 3-фосфат. Глицерол 3-фосфат образуется в основном из глюкозы, которая поступает в адипоциты с помощью инсулин-стимулированного транспортера (GLUT4). Симпатическая нервная система и нейротрансмиттер норадреналин (НА) играют важную роль в регуляции липолиза в белой жировой ткани [11]. В данной работе исследована интенсивность липогенеза и чувствительность к норадреналину культивируемых адипоцитов белой жировой ткани, выделенных у животных с ожирением и диабетом 2-го типа.

Материалы и методы исследования

Для индукции ожирения у грызунов использовали диету с высоким содержанием жира (20 г жира на 100 г корма, 7,74 кДж/г). Контрольных животных содержали на стандартной лабораторной диете (10 г жира на 100 г корма, 3,29 кДж/г). Для быстрого развития диабета 2-го типа (D2Т), характеризующегося инсулиновой резистентностью, животным вводили внутрибрюшинно стрептозотацин для подавления β-клеток поджелудочной железы (STZ, 50−100 мг/кг). Животных использовали в эксперименте спустя 2–3 недели после введения STZ. Состояние животных характеризовалось снижением концентрации инсулина на 20–30 % в сравнении с контролем, и 2–3-кратным повышением концентрации глюкозы, жирных кислот и триглицеридов, а также увеличением TNFα и CRP на 30–40 %. В экспериментах использовали первичную культуру белых адипоцитов мыши на 9 день культивирования (9 DIV), полученную из мезенхимальной фракции стволовых клеток эпидидимального жирового депо в соответствии с общепринятой методикой [13]. Для изучения накопления жировых включений белыми адипоцитами производили окраску клеток с помощью зонда Oil Red (Fluka). После промывки клеточной культуры белых адипоцитов фосфатным буфером (PBS) производили фиксацию клеток 10 % раствором формальдегида в течение 1 часа. Далее клетки трижды отмывали PBS, добавляли Oil Red и в течение 1 часа инкубировали при 37 °С. После чего зонд отмывали и культура клеток высушивалась в течение 15–20 минут. Измерение динамики цитозольного кальция ([Ca2+]i) проводили с помощью системы анализа изображений «Cell observer» (Carl Zeiss, Германия), на базе моторизованного микроскопа Axiovert 200M с высокоскоростной черно-белой CCD-камерой AxioCam HSm. Источником света служила ртутная лампа НВО 100. Возбуждение флуоресценции Fura-2 проводили при двух длинах волн (340 и 387 нм) с использованием запирающих светофильтров BP 340/30 и BP 387/15.

Результаты исследования и их обсуждение

Липогенез. К предшественникам триглицеридов, запасаемых в жировых депо адипоцитов, относятся длинноцепочечные неэстерифицированные (свободные) жирные кислоты и глицерол-3-фосфат. Внутриклеточный глицерол-3-фосфат образуется в основном из глюкозы, транспортируемой в адипоциты переносчиком GLUT-4, активность которого инициируется инсулином. На рис. 1 (верхний ряд) представлены культуры адипоцитов (3 DIV, 5 DIV, 9 DIV), выделенные у мышей с D2Т. Адипоциты на 9 день культивирования являются дифференцированными клетками. Окрашивание жировых пулов адипоцитов красителем (Oil red) показало, что в культуре, полученной из животных с диабетом 2-го типа, не происходит формирование триглицеридных пулов при использовании глюкозы в качестве субстрата (рис. 1, верхний ряд). Длинноцепочечная кислота (16:0) пальмитоил-карнитин относится к предшественникам триглицеридов, транспортируемых в клетку мембранным переносчиком. На рис. 1 (нижний ряд) показано, что культивирование адипоцитов в присутствии 10 мМ глюкозы и 100 нМ пальмитоил-карнитина инициировало образование и накопление жировых капель в клетках.

Изменение [Ca2+]i под действием норадреналина. Симпатическая нервная система и нейротрансмиттер норадреналин (НА) играют важную роль в процессе липолиза в белой жировой ткани [11]. Воздействие НА на функции жировой клетки является комплексным и активирует не только различные подтипы адренорецепторов, но и различные системы трансдукции сигнала. Считается, что НА стимулирует липолиз через активацию β-адренорецепторов, сопряженных со стимуляцией аденилатциклазы, синтезом сАМР, активацией протеинкиназы А, ключевых липаз ATGL (жировая триглицеридлипаза) и HSL (гормонально чувствительная липаза), и фосфорилированием перилипина (белка, расположенного на поверхности жировых депо и защищающего триглицериды от липолиза). Однако стимуляция липолиза норадреналином сохраняется и у мышей с нокаутом β1/β2/β3-адренорецепторов [11] и, возможно, реализуется с участием α-адренорецепторов, активация которых может сопровождаться изменением концентрации Са2+. Изменение [Ca2+]i под действием норадреналина в адипоцитах (9DIV) показано на рис. 2. На рис. 2 представлены Са2+-ответы адипоцитов, выделенных из разных животных: в норме (1), тучных (2) и с диабетом 2-го типа (3). Амплитуда Са2 + -ответа на норадреналин у тучных животных ниже в (4–12) раз по сравнению с контрольными животными, а у мышей с D2T Са2+-ответ практически отсутствует даже для очень высоких концентраций НА (рис. 2,а).

pic_22.tif

Рис. 1. Жировые пулы культивируемых адипоцитов мышей с D2T в разные сроки культивирования (3DIV, 5DIV, 9DIV). Окраска Oil red. Верхний ряд – культивирование клеток с 10 мМ глюкозы. Нижний ряд – культивирование клеток с 10 мМ глюкозы и 100 нМ пальмитоил-карнитина

Известно, что пальмитоил-карнитин и пальмитоил-КоА инициируют мобилизацию Са2+ из саркоплазматического ретикулума в скелетных мышцах [4]. Чтобы показать действие пальмитоил-карнитина на Са2+-ответ адипоцитов при аппликации НА, адипоциты здоровых и больных животных, начиная с 3-го дня, культивировали в присутствии 100 нМ пальмитоил-карнитина. Как следует из рис. 3, присутствие пальмитоил-карнитина в среде культивирования привело к восстановлению Са2+-ответа на НА в адипоцитах (9DIV), полученных из тучных животных и животных с Д2Т.

pic_23.wmf

Рис. 2. Изменение [Ca2 + ]i под действием 100мкМ норадреналина в адипоцитах, выделенных у мышей в норме (1), с ожирением (2) и Д2Т (3)

pic_24.wmf

Рис. 3. Изменение [Ca2 + ]i под действием 100мкМ норадреналина в адипоцитах, выделенных у мышей в норме (1), с ожирением (2) и Д2Т (3) при добавлении в среду культивирования 100 нМ пальмитоил-карнитина

Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что в условиях D2T наряду с инсулиновой резистентностью, приводящей к ухудшению транспорта глюкозы в клетки и подавлению синтеза жирных кислот de novo, наблюдается и резистентность к норадреналину, которая снимается при добавлении в среду культивирования пальмитоил-карнитина. Одной из важных физиологических функций адипоцитов белого жира является способность запасать энергию в виде триглицеридов, необходимую другим тканям при голодании и физической нагрузке [7]. В настоящей работе показано, что преадипоциты, выделенные у мышей с D2T, не способны в условиях культивирования в присутствии глюкозы формировать депо триглицеридов и генерировать Са2+-ответ на НА. Эффекты, по-видимому, связаны с нарушениями в транспорте глюкозы. Транспорт глюкозы в адипоцитах обеспечивается транспортером GLUT4, транслокация которого на плазматическую мембрану инициируется инсулином. При D2T имеет место резистентность к инсулину, которая вызывает нарушения в сигнальном пути IR → IRS → PI3K → PI(4,5)P3 → PKB, связанные с недостаточными фосфорилированием первых четырех компонентов и активацией PKB и оказывающие негативное влияние на транслокацию транспортера GLUT4. Для ряда клеток известно, что транслокация GLUT4 и транспорт глюкозы увеличиваются при активации АМР-киназы [9; 16; 6]. Одним из активаторов АМР-киназы, энергетического сенсора, поддерживающего баланс AMP:ATP соотношения, является пальмитат [2; 5; 14]. Также показано, что такие производные длинноцепочечных жирных кислот, как пальмитоил-карнитин и пальмитоил-КоА, в микромолярных концентрациях стимулируют связывание ‘Н-рианодина и вызывают мобилизацию Са2+ из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц млекопитающих. Увеличение [Ca2+]i и AMP (при уменьшении клеточного АТР) приводит к синергичной активации АМР-киназы [4; 8].

Эндоплазматический ретикулум не только играет центральную роль в липидном и белковом биосинтезе, синтезирует почти все секретируемые белки и продуцирует трансмембранные белки и липиды для большинства клеточных органелл, но и играет важную роль в регуляции [Ca2+]i. Как следует из результатов, полученных в данной работе, активация адипоцитов (9DIV), выделенных у животных с диабетом 2-го типа, норадреналином недостаточна для генерации Ca2+ транзитного ответа. Добавление в среду культивирования пальмитоил-карнитина восстанавливало способность адипоцитов генерировать Са2+-ответ на норадреналин и важную физиологическую функцию запасания триглицеридов.

Заключение

В данной работе показано, что наряду с инсулиновой резистентностью в клетках белого жира в условиях ожирения и диабета 2-го типа наблюдается резистентность к адренергической стимуляции. Кальциевый ответ адипоцитов, полученных из тучных животных и мышей с индуцированным диабетом 2-го типа на аппликацию различных концентраций норадреналина, значительно снижен или отсутствует.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы № 7 Президиума РАН (проект № 01201258223); Министерства образования и науки Российской Федерации (ГК 16.512.11.2092, № 01201179771); ФНМ – проект № 01201256033; РФФИ – № 10-04-01306.

Рецензенты:

Новоселов В.И., д.б.н., профессор лаборатории механизмов рецепции, Институт биофизики клетки РАН (ИБК РАН), г. Пущино;

Асланиди К.Б., д.ф.-м.н., лаборатория регуляции внутриклеточных процессов, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (ИТЭБ РАН), г. Пущино.

Работа поступила в редакцию 10.01.2013.