Бактерицидный и цитотоксический эффекты низкотемпературной газоразрядной плазмы широко представлены в зарубежных научных публикациях последнего десятилетия [9, 6]. В зоне разряда в процессе плазмохимических реакций образуются радикальные продукты, вызывающие биоцидные и другие биомедицинские эффекты [8, 5]. В российских исследованиях 2012 года проведен детальный анализ и рассчитаны концентрации продуктов, образующихся как в газовой, так и в жидкой фазе при генерации излучения плазмы искрового разряда. Доказано образование соединений, содержащих группы CN, NH и органических соединений, содержащих группы CH, CC. Исследован механизм снижения рН до уровня 2,8–3, показано, что основной вклад в снижение рН раствора дают окислы азота (90 %) и органические соединения (10 %). Идентифицированы и рассчитаны концентрации радикалов NH4+, HO2•, кислотных остатков ([H+]), окислителей, восстановителей, содержание перекиси водорода и глубина проникновения излучения в жидкость [8].
При обработке электрическим разрядом органических соединений наблюдалось разложение и образование новых органических соединений [7]. Активные частицы, образующиеся в жидкой и газовой фазе разряда, взаимодействуют с растворёнными веществами в тонком поверхностном слое, а продукты взаимодействия распространяются внутри жидкости или клетки за счёт диффузии и под действием электрического поля, создаваемого током разряда. Оксиды азота и радикальные продукты участвуют во многих метаболических процессах, в частности, таких как апоптоз и пролиферация клеток [2]. Поэтому исследование состояния биомолекул, клеток и организма в целом в ответ на излучение плазмы искрового разряда имеет большое значение для биомедицинских исследований.
Исследования, позволяющие оценить состояние белков и липидов после воздействия излучения плазмы, до настоящего времени не проводились.
Поэтому целью данной работы было исследование влияния излучения плазмы искрового разряда на флуоресценцию растворов аминокислоты триптофана, альбумина и гемоглобина и образование молекулярных продуктов перекисного окисления липидов в липосомах из холестерина, триглицеридов и общих липидов эукариотических клеток.
Материалы и методы исследования
В данной работе излучение низкотемпературной плазмы генерировалось устройством со следующими характеристиками искрового разряда: длительность импульса – 100 мкс, ток 1 кА, напряжение – 11 кВ, энергия, выделяемая в одном импульсе 5,9∙10-2 Дж, частота импульса – 10 Гц.
Разряд формировали следующим образом. Импульсный конденсатор (рабочее напряжение 10 кВ) заряжали через балластное сопротивление от источника питания, U = 11 кВ. Полярность источника питания не имела значения. Электроды из нержавеющей стали диаметром 2 мм имели суммарную длину не более 15 мм (расстояние между электродами ~3 мм). Пробивное напряжение промежутка составляло 6 кВ. Длительность переднего фронта 50 нс.
При подаче высокого напряжения происходил искровой разряд. При прохождении электрического тока через разрядный промежуток газ нагревается до высокой температуры. В зоне разряда происходят плазмохимические реакции. Горячий плазменный шнур является источником ультрафиолетового (УФ) излучения. В отличие от плазмы, которая контактирует с обрабатываемым объектом только на поверхности, УФ-излучение может проникать внутрь объекта. В случае открытого электрического разряда на объект воздействуют продукты, образующиеся в канале разряда, и УФ-излучение [8].
В экспериментах использовали D-триптофан производства Reanal (Венгрия), альбумин сывороточный бычий производства Biomed-Krakov (Польша), гемоглобин бычий производства Koch-Light Laboratories Ltd (Англия), холестерин производства Panreac (Испания), триглицериды Vital-diagnostics (Россия), общие липиды Vital-diagnostics (Россия).
Готовились растворы D-триптофана 100; 10; 1 мМоль, альбумина 2,5; 0,25; 0,025; 0,0025 г и гемоглобина 70; 7; 0,7; 0,07 мг на 50 мл раствора Хенкса.
Взвесь мультиламелярных липосом в растворе Хенкса готовили методом замораживания–оттаивания. Концентрация холестерина, триглицеридов и общих липидов − 10 и 1 мМ/л.
Растворы белков и взвеси липосом объемом 4 мл обрабатывались излучением искрового разряда в течение 30, 60, 300, 600 и 1200 с. Контролем служили растворы без воздействия. Общее количество проведенных исследований − 540.
Окислительную модификацию белков оценивали по флюоресценции триптофана, длина волны возбуждения − 280–300 нм, длина волны регистрации флюоресценции − 350 нм. Изучение окислительной модификации липидов проводили по спектрам поглощения и по накоплению молекулярных продуктов при 215, 235, 245, 275 нм. Исследование проведено на спектрофлуориметре «Флюорат-02 Панорама» (Санкт-Петербург, 2009 г.).
Результаты исследования и их обсуждение
Анализ окислительной модификации холестерина, триглицеридов и общих липидов в ультрафиолетовой области показал, что воздействие излучением плазмы не приводит к накоплению первичных и вторичных молекулярных продуктов окисления липидов. В то же время обработка липосом из холестерина приводит к накоплению продуктов, поглощающих в области 215 нм. Воздействие излучением плазмы разряда на липосомы из триглицеридов вызывает снижение уровня низкомолекулярных неокисленных продуктов при 215 нм.
Одним из основных критериев свободно-радикального окисления является образование в полиненасыщенных жирных кислотах сопряженных (коньюгированных) связей и, соответственно, первичных молекулярных продуктов – диеновых конъюгатов и вторичных продуктов триеновых конъюгатов. Из обзора R. Alan Wheatley [11] известно, что при спектроскопии липидов в области 210–217 нм поглощают низкомолекулярные неокисленные продукты в некоторых случаях с двойными связями, в области 230–238 нм − молекулы транс-, и транс-сопряженные – коньюгированные двойные связи, в области 243–250 нм цис- и транс-коньюгированные двойные связи, в области 274–280 нм − кетоны и диены и их вторичные производные.
Т.к. после воздействия разрядом не накапливаются первичные и вторичные продукты цепного окисления липидов, то можно было бы предположить, что окисление липидов под действием излучения плазмы не происходит. Однако известно, что при генерации искрового разряда накапливается HO2• радикал. И перекисное окисление липидов может быть инициировано радикалами HO2•, если энергия отрыва атома водорода по C–H связи заметно меньше или порядка 88 ккал/моль. Энергия связи C–H для углеводородов и, в частности, для жирных кислот лежит в пределах от 60 до 110 ккал/моль [12, 3]. По данным Богач П.Г. [1], в ненасыщенных жирных кислотах энергия отрыва атома водорода, расположенного в альфа-положении относительно двойной связи, составляет 87 ккал/моль, поэтому отрыв атома водорода в таких соединениях радикалами HO2• возможен. Таким образом, радикал HO2• может оторвать атом водорода от липида, в котором есть хотя бы одна двойная связь. Энергии фотонов с длиной волны 253,7 нм (поток УФ-фотонов (2,5 ± 0,3)∙1015 (см2∙с)-1 с плотностью энергии (2 ± 0,3)∙10-3 Дж (см2∙с)-1 [8]) в некогерентном излучении плазмы искрового разряда с избытком достаточно для отрыва атома водорода в любом липиде. Однако взаимодействие молекул с фотонами носит резонансный характер. Если в веществе нет пика поглощения для энергии фотона, взаимодействие очень маловероятно. В этом случае инициирование может происходить с участием радикала HO2•, который будет образовываться при длине волны фотона меньше 260 нм.
Вероятно, именно поэтому после обработки липосом не накапливались продукты первичной деградации липидов, а образовывались или разлагались вещества, которые поглощают активные частицы (радикалы или фотоны). Данные, полученные в нашей работе, согласуются с результатами [5]. В работе исследовалось изменение концентрации диеновых и триеновых конъюгатов, малонового диальдегида и оснований Шиффа в прокариотических клетках под действием излучения искрового разряда. Установлено, что концентрация этих продуктов снижается. Это означает, что под действием излучения происходит разрушение продуктов окисления липидов, причем скорость разрушения соизмерима со скоростью их образования.
Вода, белки и липиды являются основными компонентами клетки. Образование активных радикальных продуктов под действием излучения плазмы искрового разряда в воде рассмотрены в работе [8]. Поэтому во второй части нашей работы мы исследовали уровень окисления растворов триптофана и таких белков, как альбумин и гемоглобин.
Известно, что белки обладают люминесценцией в ультрафиолетовой области спектра. Установлено, что ответственными за ультрафиолетовую люминесценцию белков являются входящие в их состав ароматические аминокислоты: триптофан, тирозин и малой степени фенилаланин. Триптофан – наиболее интенсивно флуоресцирующая аминокислота в белках. Около 90 % всей собственно флуоресценции белков обычно обусловлено триптофановыми остатками [10]. Поскольку триптофан относится к группе аминокислот, в наибольшей степени подверженным свободно-радикальным атакам, то, следовательно, он является достаточно чувствительным маркером окислительного стресса [4].
При оценке окислительной модификации растворов триптофана, альбумина и гемоглобина было показано, что увеличение времени воздействия излучением плазмы искрового разряда приводит к тушению флуоресценции триптофана, т.е. к окислительной деградации белков. После обработки растворов триптофана и гемоглобина флюоресценция снижается в 2–3 раза, а в растворах альбумина − в 6 раз. Таким образом, растворы альбумина в большей степени подвергаются окислительной деградации, чем растворы гемоглобина.
Заключение
Излучение плазмы искрового разряда приводит к деградации липидов и белков увеличением времени воздействия. В липосомах не накапливаются первичные и вторичные молекулярные продукты окисления липидов, однако наблюдается накопление и расходование низкомолекулярных недоокисленных продуктов, поглощающих в коротковолновой области ультрафиолетового спектра. В растворах белков увеличение времени воздействия излучением плазмы искрового разряда приводит к тушению флуоресценции триптофана, т.е. к окислительной модификации белков.
Рецензенты:
Малиновская С.Л., д.б.н., профессор кафедры медицинской физики и информатики ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Нижний Новгород;
Обухова Л.М., д.б.н., старший преподаватель кафедры биохимии им. Г.Я. Городисской ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Нижний Новгород.
Работа поступила в редакцию 17.12.2012.