Сведения о связи кобаламин-гемостаз ограничены, но позволяют утверждать:
1. Состояние гемостаза зависит от обеспеченности организма кобаламином (КБ), влияющим на тромбоцитопоэз, активность тромбоцитов и плазминовой системы, особенно на фоне атеросклеротических изменений в сердечно-сосудистой системе [2, 5, 17, 18].
2. Известны заболевания, протекающие с нарушениями гемостаза и дефицитом КБ [15, 19].
3. В эксперименте и клинике выявлено влияние КБ на некоторые про- и антикоагулянты, однако неясно, как влияет дефицит или дополнительное введение КБ на гемостаз в целом [13].
4. Данные о влиянии КБ на интегральные показатели гемостаза (непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину) единичны [14].
Следовательно, необходимо далее изучать связи между обеспеченностью организма КБ и гемостазом, обращая внимание на эффекты его дефицита и избытка при состояниях, протекающих с тромбофилией или кровоточивостью [14].
Цель работы - изучить влияние на НВСК, фибринолиз и толерантность к тромбину (ТкТР), на липидпероксидацию (ЛПО) и антиоксидантный потенциал (АОП) тромбоцитов при содержании животных на рационе с разными дозами КБ на фоне алиментарной гиперхолестеролемии разного уровня.
Материалы и методы исследований
Опыты провели на нелинейных белых крысах (самцы, 180 ± 16 г), получавших сбалансированный пищевой рацион [4, 9, 10, 18]. Выбор крыс связан с тем, что большинство исследований по изучению гемостаза выполняли на этих животных [17]. В атерогенный рацион входил холестерол (ХЛ) по 0,2 г на особь в сут, чему предшествовало введение 6-метилтиоурацила (0,3 мг на особь в сут, 30 дней), который нарушает обмен липидов, снижая функциональную активность щитовидной железы, что ускоряет развитие гиперхолестеролемии и атеросклеротических сдвигов у крыс, устойчивых к избыточному поступлению с пищей ХЛ [4]. Контрольные группы получали рацион питания без 6-метилтиоурацила и холестерола.
Пробы крови брали в шприц с 3,8%-м раствором цитрата натрия (9:1 по объему) из обнаженной яремной вены у наркотизированного диэтиловым эфиром животного, фиксированного на препаровочном станке. Рану закрывали 2-3 швами (кетгут). В плазме крови устанавливали уровень маркеров НВСК: продуктов деградации фибрина (ПДФ) [6], растворимых комплексов мономерного фибрина (РКМФ) [11], D-димеров («D-dimer test", Roche), фф. Р3 и Р4 в плазме по описанию [1]. Концентрацию в плазме осаждаемого тромбином фибриногена (ФГ) определяли спектрофотометрически [5], а Хагеман-зависимый фибринолиз по описанию [3]. Толерантность к тромбину (ТкТР) устанавливали согласно патенту [7]. Липидпероксидацию (ЛПО) в тромбоцитах и их антиоксидантный потенциал (АОП) оценивали, определяя уровень диеновых конъюгат (ДК) и продуктов, реагирующих с тиобарбитуратом (ТБК), период индукции (ПИ) и скорость окисления (СО) устанавливали по описанию [12] на флуориметре «Биан 130». Число n составляло 8-9 во всех группах и этапах.
Статистический анализ проводили с помощью медико-биологической программы Biostat 4.03 [8], используя вариационную статистику для малых рядов, вычисляя среднюю арифметическую, среднюю ошибку, среднеквадратическое отклонение, доверительный коэффициент Стъюдента и степень вероятности (р). Различия считали достоверными при значениях степени вероятности < 0,05.
Использованы: тромбин, фибриноген (ФГ) бычьей крови, тромбопластин, каолин и буфер Михаэлиса («Технология-стандарт»), набор «D-dimer test» («Roche»), изопропанол, хлорбензол, бутанол и кальция хлорид х.ч., цианокобаламин (ЗАО «Уфавит»), казеин и крахмал маисовый пищевой, масло подсолнечное рафинированное, смесь Осборна-Менделя (все реагенты х.ч.реагенты), ледяная уксусная кислота, концентрированная серная кислота, уксусный ангидрид, абсолютный этанол. Число n во всех группах крыс равно 8.
Результаты исследований и их обсуждение
Вначале изучили эффекты возрастающих доз ХЛ на НВСК, фибринолиз и ТкТР на фоне рациона с кобаламином в соответствии с суточной потребностью (1 мкг/кг - полноценный рацион). Подопытные группы получали ХЛ по 0,2, 0,4 или 0,8 г/кг в сут, пробы брали в конце 6-й и 8-й недели. Из данных таблицы следует, что введение ХЛ (0,2 г/кг) заметно повышает уровень всех плазменных маркеров НВСК (наименьшая доза, использующаяся при оценке влияния ХЛ на атерогенез) к концу 6-й и особенно 8-й недели. Активность фибринолиза не меняется, а ТкТР падает к концу опыта. Увеличение дозы ХЛ в рационе сопровождается пропорциональным ускорением НВСК (выше доза - выше уровни всех маркеров), снижается уровень ФГ, что указывает на его ускоренное потребление, усиливающееся с дозой ХЛ.
Падает и ТкТР, а фибринолиз меняется мало. Уровень липидпероксидов с увеличением дозы ХЛ и длительности введения также повышается, а АОП, напротив, падает.
Изменения НВСК, фибринолиза, ТкТР, ЛПО и АОП при введении возрастающих доз холестерола (0,2, 0,4 или 0,8 г/кг в течение 6 или 8 недель)
|
Показатели |
Полноценный рацион без ХЛ |
Тот же рацион с ХЛ (0,2 г, 0,4 и 0,8 в сут) в строках 1, 3 и 3-й через: |
|
|
6 недель |
8 недель |
||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
|
Ф, Р3,% |
87,9 ± 1,2 |
101 ± 1,8* 112 ± 1,9* 122 ± 2,3* 101 ± 1,8* |
122 ± 1,8*» 127 ± 1,9*» 134 ± 2,2*» |
|
Ф, Р4, с |
3,1 ± 0,02 |
6,2 ± 0,04* 7,9 ± 0,05* 8,8 ± 0,04* |
8,2 ± 0,05*» 8,9 ± 0,03*» 10,2 ± 0,06*» |
|
ФГ, г/л |
2,1 ± 0,02 |
1,7 ± 0,08* 1,6 ± 0,04* 1,4 ± 0,09* |
1,5 ± 0,08*» 1,3 ± 0,03*» 1,2 ± 0,02*» |
|
ПДФ, мг% |
15,1 ± 0,3 |
19,7 ± 1,1* 23,7 ± 1,4* 29,7 ± 1,8* |
23,7 ± 1,4*» 25,7 ± 1,5*» 29,8 ± 1,7*» |
|
РКМФ, мкг/мл |
24,1 ± 1,1 |
31,1 ± 1,2* 35,2 ± 1,4* 41,0 ± 1,8* |
31,1 ± 1,2* 38,8 ± 1,3* 40,9 ± 1,6* |
|
D-Д, мкг/мл |
0,20 ± 0,008 |
0,29 ± 0,004* 0,35 ± 0,003* 0,40 ± 0,005* |
0,34 ± 0,006*» 0,42 ± 0,007*» 0,54 ± 0,010*» |
|
Фибринолиз, мин |
8,5 ± 0,03 |
9,1 ± 0,09 10,8 ± 0,06 12,3 ± 0,11 |
9,9 ± 0,09* 11,4 ± 0,11* 13,8 ± 0,09* |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
|
ТкТР, % |
100 ± 2,9 |
80,3±1,2* 75,7±1,9* 69,3±2,2* |
72,3±1,2*» 65,3±1,5*» 54,3±1,8*» |
|
ДК, мг ЛП |
0,051 ± 0,002 |
0,067 ± 0,006* 0,067 ± 0,006* 0,067 ± 0,006* |
0,073 ± 0,008*» 0,088 ± 0,006*» 0,093 ± 0,009*» |
|
ТБК, ед,/мг ЛП |
0,70 ± 0,03 |
0,85 ± 0,04* 0,85 ± 0,04* 0,85 ± 0,04* |
0,93 ± 0,03*» 1,53 ± 0,04*» 1,70 ± 0,06*» |
|
ПИ, мин/мл |
45,7 ± 1,1 |
34,3 ± 1,1* 34,3 ± 1,1* 34,3 ± 1,1* |
27,3 ± 1,0*» 29,8 ± 1,1*» 32,4 ± 1,2*» |
|
СО, мм3/мл/мин |
0,75 ± 0,02 |
0,87 ± 0,05* 0,87 ± 0,05* 0,87 ± 0,05* |
1,26 ± 0,08*» 1,44 ± 0,09*» 1,97 ± 0,10*» |
Во 2-й группе опытов изучали влияние ХЛ на те же показатели, увеличивая дозу КБ в рационе и длительность опыта (6 и 8 недель крысы получали ХЛ в дозах 0,4; 0,6 или 0,8 г на особь в сут на фоне КБ в дозах, превышающих суточную потребность в 2, 8 или 16 раз).
И в этом случае подтвердилось свойство ХЛ ускорять НВСК - достоверно вырос уровень в плазме маркеров НВСК и выявилось, что введение КБ при всех испытанных дозах ХЛ ограничивает эффекты липида на НВСК и ТкТР, а фибринолиз активируется при 8- и 16-кратной дозе КБ. Скорость ЛПО под влиянием КБ уменьшалась, а АОП возрастал.
Заключая, выделим основные положения:
1. Высокие дозы ХЛ в полноценном рационе ускоряют НВСК до степени, которую можно рассматривать как начальную стадию ДВС крови.
2. Избыток КБ в дозах, адекватных малым лечебным, ограничивает эти сдвиги, а в дозах, адекватных высоким лечебным, усиливает их, и независимо от дозы ограничивает вызываемое введением холестерола снижение толерантности к тромбину.
3. Сдвигам скорости НВСК при гиперхолестеринемии сопутствуют ускорение ЛПО, снижение антиоксидантного потенциала тромбоцитов и активация фибринолиза.
Рецензенты:
Ральченко И.В., д.б.н., профессор кафедры фармацевтической технологии и фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздравсоцразвития России, г. Тюмен№
Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, зав. кафедрой биохимии ГБОУ ВПО «Челябинская медицинская академия» Минздравсоцразвития России, г. Челябинск.
Работа поступила в редакцию 12.12.2012.