Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

A METHOD FOR OBTAINING AN ANTIGEN WITH A MOLECULAR WEIGHT OF 45KDA FROM MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Alfredo Elder 1 Vershinina V.I. 1 Khaertynov K.S. 2 Gerasimova S.V. 2 Urazov N.G. 3 Khaertynova I.M. 2
1 Kazan (Volga) Federal University
2 Kazan State Medical Academy, the Health Ministry of Russia
3 National Center for the Prevention and Control of AIDS and Infectious Diseases MH pT3
This work describes a method for obtaining an antigenic product with a molecular mass of 45 kDa from M. tuberculosis cells. The antigenic product reacts with the serum of patients diagnosed with tuberculosis during immunoblot analysis. This result which suggests that the derived antigen exhibited 100 % sensitivity is questionable. From literature, it is known that 100 % of anti-tuberculosis antibodies are only observed during fibrous-cavernous tuberculosis and bacterial discharge. In all the other forms of tuberculosis, the percentage detection of anti-tuberculosis antibodies was significantly lower. Thus, we have obtained from M. tuberculosis cells, an antigenic product with a molecular mass of 45 kDa with less than 5 % ballast proteins. We assume that this antigen is a glycoprotein localized on the surface of the bacterial cell. This assumption is based on the sparingly treatment of bacterial cells (10 % aqueous DMSO), and on the similarity in molecular mass to that of the antigen complex, 45–47 kDa.
antigen
Mycobacterium tuberculosis
immunobloting
1. Adambekov D.A., Kurmanov R.A., Baensky A.V., Litvinov V.I. Diagnostic value of the study of a specific anti-tuberculosis immunity in patients with tuberculosis and other lung diseases // Problems of tuberculosis. 1997, no. 3, p. 20–22.
2. Gladkov S.E., Reshetnikov S.S., Pryakhin V. Experience of using a test system «AT-Tube-Best» for the diagnosis of tuberculosis // News «Vector-Best» no. 4 (42) 2006, pp. 2–4.
3. Karpov A.V. Comparative effectiveness of early detection of tuberculosis by immunological methods // Bulletin of the Novgorod State University, 1998.
4. Chukanov V.I., Slogotskaya L.V. Features of diagnosis and effective treatment of patients with pulmonary tuberculosis without bacteria // Problems of Tuberculosis and Lung Disease, 2007, no. 11, pp. 22–25.
5. Diagbouga S., Fumoux F., Zoubga A., Sanou P.T., Marchal G. Immunoblot analysis for Serodiagnosis of tuberculosis Using a 45/47- Kilodalton Antigen Complex of Mycobacterium tuberculosis. // Clinical and Diagnostic Laboratory immunology, 1997, May, Vol. 4 no. 3, pp. 334–338.
6. Houghton R.L., Lodes M.J., Dillon D.C., Reynolds L.D., day C.H., McNeill P.D., Hendrickson R.C., Skkeiky Y.A.W., Sampaio D.P., Bararo R., Lyashchenko K.P., Reed S.G. Use of Multiepitope Polyproteins in Serodiagnosis of Actiye Tuberculosis. // Clin diagn Lab Immmmunol. 2002 july; 9(4): 883–891.5
7. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4. Nature, London, 1970, Vol. 227, pp. 680–685.
8. Mukherjee S., Daifalla N., Zhang Y., Douglass J., Brooks L., Vedvick T., Houghton R., Reed S.G., Campos-neto A. Potential Serological Use of a Recombinant Protein That Is a Replica of a Mycobacterium tuberculosis Protein Found in the Urine of Infected Mice. // Clin diagn Lab Immmmunol. 2004 March; 11(2): 280–286
9. Roman F., Horn C., Pescher P., Namane A., Riviere M., Puzo G., Barzu O. and Marchal G. Deglycosylation of the 45/47 Kilodalton Antigen Complex of Mycobacterium tuberculosis Decreases Its Capacity To Elicit In Vivo or In Vitro Cellular Immune Responses // Infection and Immunity, 1999 V.67 № 11.P. 5567-5572..
10. Towbin H., Stähein T. and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350, 1979.
11. Waters W.R., Palmer M.V., Bannantine J.P., Whipple D.L., Greenwald R., Esfandiari J., Andersen P., McNair J., Pollock J.M., Lyashchenko K.P. Antigen recognition by serum antibodies in white-tailed deer (Odocoileus virginianus) experimentally infected with Mycobacterium bovis // Clin diagn Lab Immmmunol. 2004 September; 11(5): 849–855.

Серологические методы наиболее удобны для диагностики инфекционных болезней, так как для анализа используется легко доступный клинический материал: сыворотка или плазма крови человека. Однако эти методы, включая метод ИФА, не обладают достаточной чувствительностью для диагностики туберкулеза [2]. Так, при использовании препарата, выделенного из клеточных стенок микобактерий H37Rv и содержащего антиген с молекулярной массой 38–42 кДа, противотуберкулезные антитела (ПТАТ) были выявлены только у 76,7 % больных туберкулемой и у 70,0 % больных инфильтративным туберкулезом [1]. При использовании антигенного комплекса с молекулярной массой 45–47 кДа чувствительность метода составила 40 % [5]. На использованных в недавнем прошлом антигенных препаратах у лиц с установленным диагнозом туберкулез противотуберкулезные антитела (ПТАТ) обнаруживаются в 100 % случаях только при фиброзно-кавернозном туберкулезе и при бактериовыделении [3]. Однако пациенты с фиброзно-кавернозной формой заболевания составляют небольшую часть общего количества больных туберкулезом. При очаговом туберкулезе ПТАТ обнаруживают только в 31 % случаев, а при туберкулезе бронхов − в 15,5 % случаев [3]. По данным Чуканова В.И. и соавт. ПТАТ выявляют у больных туберкулезом в среднем в 71 % случаев [4].

При использовании отдельных рекомбинантных антигенов Mycobacterium tuberculosis выявляемость ПТАТ в сыворотках больных туберкулезом за исключением ВИЧ-инфицированных пациентов также невысока − около 60 % [8]. Есть данные, что использование набора значительного количества рекомбинантных антигенов приводит к улучшению результата: ПТАТ выявляли у 93 % больных туберкулезом [6,11].

Цель настоящей работы заключалась в получении антигенного препарата из Mycobacterium tuberculosis, который отличался бы высокой активностью и специ­фичностью.

Материалы и методы исследования

Культуру Mycobacterium tuberculosis штамм «Академия», выращивали на твердой питательной среде Левенштейна-Йенсена в течение 40–60 дней, затем переносили в жидкую питательную среду Сотона. Наращивание бактериальной массы в последней проводили в аппарате «Bacteck» при 37 °С в течение 7–10 суток.

Антигенный препараты из Mycobacterium tuberculosis получали обработкой бактериальных клеток 10 % диметилсульфоксидом (ДМСО) с последующей дез­интеграцией стеклянными шариками в гемогенизаторе.

Белковые фракции исходного, промежуточного и конечного препаратов выявляли с помощью электрофореза в 12,5 % полиакриламидном геле (ПААГ) по Леммли [7].

Для определения молекулярной массы антигенов использовали набор белков «Broad Range» (BIO-RAD).

Гель-фильтрацию выполняли на колонках размером 2×100 см, заполненных соответственно сефадексами G-200.

Полученные антигенные препараты анализировали с помощью иммуноблотинга [10]. Иммуноблотинг выполняли по методике, описанной в инструкции к набору «NEW LAV BLOT 1» (BIO-RAD).

Результаты исследования и их обсуждение

Бактериальные клетки, выращенные на среде Сотона, осаждали центрифугированием в течение 30 минут при 8000 g и трижды промывали фосфатным буфером (рН 7,4) с 0,15 М NaCl. Клетки суспендировали в 10 % водном растворе ДМСО и в течение 30 минут гомогенизировали. Гомогенат подвергали исчерпывающему диализу против дистиллированной воды в течение ночи против 0,05 М трис-НCl буфера с рН 7,4–7,6. Центрифугированием в течение 30 минут при 8000 g освобождались от обломков клеток. Полученный ДМСО-экстракт служил в дальнейшим исходным материалом для получения антигенных препаратов из Mycobacterium tuberculosis.

Для выделения антигенных фракций ДМСО-экстракты использовали различные подходы: экстракция растворителями при различных значениях рН, высаливание, а также метод гель-фильтрации.

На первом этапе очистки рН ДМСО-экстракта доводили до значения 3,5–4,0 уксусной кислотой и выдерживали в течение 24 часов при температуре 4 °С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 8000 g в течение 20 минут. Осадок растворяли 0,05 М трис-НCl (рН 7,4–7,6) в 1/2 первоначального объема, ДМСО-экстракта рН доводили 2 М раствором NaOH до значения 7,4–7,6.

Способы получение антигенных препаратов Mycobacterium tuberculosis

Препараты

Способы фракционирования

А

Осадок ДМСО-экстракта после обработки уксусной кислотой (3,5–4,0)

Б

Супернатант из (А)

В

Препарат (А) + 30 % этанола

Г

Препарат (Б) после доведения до pH-4,0

Д

Препарат (в) + 70 % этанола

Е

Препарат (в) + (NH4)2SO4

Иммуноблоты, полученные на материале осадка и супернатанта, представлены на рис. 1 (а и б соответственно). Их анализ показывает, что спектры серопозитивных фракций осадка и супернатанта мало чем отличаются между собой. В тоже время легко заметить индивидуальные различия в спектрах серопозитивных фракций, которые проявляются с сыворотками 4 больных туберкулезом. Наибольшая вариабельность по серологической активности наблюдается для белков, имеющих молекулярные массы 11–13,5; 15,5–22; 24,5–30 и 53 кДа. Что касается белков с молекулярной массой 45 кДа, то антиген к ним встречается во всех исследуемых сыворотках. Следует отметить, что белки с молекулярной массой 45 кДа более полно представлены в препаратах, полученных на основе супернатантов.

pic_3.tif

Рис. 1. Иммуноблотинги антигенных препаратов Mycobacterium tuberculosis, полученных разными способами, с сыворотками больных туберкулезом

Поэтому было проведено дополнительное осаждение супернатанта 30 % этанолом. Из рис. 1, в видно полученные в результате осаждения этанола белки обладали выраженной серологической активностью. Обращает внимание тот факт, что сыворотка пациента № 1 весьма активно реагирует с фракциями в диапазоне М.м. 31 – 200 кДа, а сыворотка больного № 4 с белками мажорной фракции с М.М. 24,5 кДа.

Анализ антигенного спектра препарата Г свидетельствует о том, что большая доля серологической активности приходится на белки с низкой массой 6,5 кДа и на белки с молекулярной массой более 45 кДа.

В препаратах Д, полученных из того же супернатанта при внесении в него 70 % этанола, спектр серопозитивных фракций мало отличался от антигенного спектра препарата Г. Исключение представлял спектр серопозитивных фракций пациента № 2. В его сыворотке присутствуют антитела, с которыми активно реагируют белки, имеющие молекулярную массу 18 и 19,5 кДа. Дополнительное осаждение сульфатом аммония не повлияло на антигенное состояние препарата.

Ввиду своеобразного распределения активности, которая в основном располагалась в области молекулярных масс более 45 кДа и менее 1 кДа, для дальнейшей очистки использовали метод гель-фильтрации.

Гель-фильтрацию сульфат-аммонийного осадка проводили на колонках 2×100 см с сефадексами G-200. Материал элюировался двумя пиками.

pic_4.tif

Рис. 2. Электрофорез антигенного препарата в 12,5 % ПААГ (по Леммли). Локализацию белковых фракций выявляли, используя краситель Кумасси ярко-голубой G-250

На рис. 2 представлена электрофореграмма материала 1 пика, которая свидетельствует о достаточной однородности препарата. Следует отметить, что при окрашивании белков, фракционированных в геле, азотнокислым серебром обнаруживаются минорные фракции, на долю которых приходится менее 5 % от общего количества белка.

На рис. 3 представлены иммуноблоты, полученные на материале первого пика с 24 сыворотками пациентов больных туберкулезом легких. Видно, что на всех иммуноблотах весьма четко представлена одна серопозитивная фракция с молекулярной массой в 45 кДа.

Следует отметить, что в этом эксперименте использовали произвольно взятые сыворотки пациентов больных легочной формой туберкулеза. Данный результат предполагает, что на полученном антигене проявляется 100 % чувствительность, что вызывает определенные сомнения. По литературным данным известно, что 100 % противотуберкулезные антитела (ПТАТ) выявляются только при фиброзно-кавернозном туберкулезе и при бактериовыделении [10], во всех остальных формах туберкулеза процент выявляемости ПТАТ был значительно ниже.

pic_5.tif

Рис. 3. Иммуноблоты, полученные на антигене 45 кДа с 24 сыворотками больных туберкулезом легких

Таким образом, в результате проведенной работы из клеток M. tuberculosis был получен антигенный препарат с молекулярной массой 45 кДа, который содержит менее 5 % балластных белков. Предположительно этот антиген представляет собой гликопротеин, локализованный на поверхности бактериальной клетки. Данное предположение основывается на щадящем приеме обработки бактериальных клеток (10 % водный раствор-ДМСО) и на сходстве молекулярных масс 45–47 кДа антигенного комплекса, описанного в статьях [5, 9].

Вывод

Предложен способ выделения серологических активных антигенных с молекулярной массой 45 кДа из M. tuberculosis штамм «Академия» включают обработку клеток 10 % раствором ДМСО с осаждением и фракционированием супернатанта уксусной кислотой, этанолом и хромотографией на сефадефа g-200

Белок с молекулярной массой 45 кДа обладал выраженной серологической активностью в реакциях иммуноблотинга сыворотками больных с установленным диагнозом туберкулеза.

Рецензенты:

Ильинская О.Н., д.б.н., профессор кафедры биохимии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г. Казань;

Коксин В.П., д.х.н., старший научный сотрудник лаборатории Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, г. Казань.

Работа поступила в редакцию 26.11.2012.